復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗死模型大鼠梗死體積的影響及其分子機(jī)制研究

沈俊逸 趙智明 劉春麗 壯雨雯 徐文俊 蔡 輝

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇南京210002）

腦梗死因高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率及高復(fù)發(fā)率與心臟病、惡性腫瘤組成人類的三大死亡病因，給人類的健康造成極大的威脅[1]。糖尿病并發(fā)腦梗死是糖尿病最常見(jiàn)的血管并發(fā)癥[2]。microRNAs是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，長(zhǎng)約19～25bp，具有高度保守、非編碼、短序列等特性，在轉(zhuǎn)錄后階段調(diào)控相關(guān)靶基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示microRNAs與糖尿病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[3-4]。miR-320還可以抑制血管生成，其抑制劑有可能成為一種治療糖尿病及其慢性并發(fā)癥的有效藥物。miR-320的靶點(diǎn)包括VEGF、bFGF、IGF-1及其受體IGF-1R在內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子及其受體[5]。miR-320負(fù)性調(diào)控IGF-1及其受體IGF-1R，對(duì)糖尿病誘發(fā)的血管病變有重要影響。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)原醒腦湯可以減輕胰島素抵抗，促進(jìn)血管新生因子VEGF以及SDF-1、CXCR4的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，減少腦梗死體積[6-7]，但是復(fù)原醒腦湯對(duì)miR-320的表達(dá)以及相關(guān)靶點(diǎn)的影響還未得到證實(shí)。本研究制作糖尿病腦梗死大鼠模型，觀察復(fù)原醒腦湯對(duì)模型大鼠缺血腦組織miR-320以及IGF-1表達(dá)的影響，以期從microRNAs對(duì)基因表達(dá)調(diào)控作用途徑闡述復(fù)元醒腦湯促進(jìn)糖尿病腦梗死缺血區(qū)血運(yùn)重建的分子機(jī)制與有效作用靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 150只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±25）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2011-009。

1.2 藥物與試劑 TTC染色液（2%）購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；蛋白濃度BCA法測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；肝素鈉、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、組織裂解液（RIPA）和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于上海市碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-IGF1抗 體，Anti-IGF1 Receptor抗 體 和Anti-GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)abcam公司；RNA抽提試劑盒購(gòu)于美國(guó)ZYMO RESEARCH公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Takara公司（大連寶升生物）。復(fù)元醒腦湯，藥物組成：人參10g（單煎），三七10g，石菖蒲12g，水蛭10g，益母草30g，生南星15g，制大黃9g（后下），濃度388g/L，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科制備。

1.3 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo Fisher，美國(guó)），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，Tanon-5200Multi），正置顯微鏡（OLYMPUS，日本），透射電鏡（日本電子，JEM-2000EX）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 將實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥組，每組30只。糖尿病模型制作：模型組、西藥組和中藥組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）50mg/kg，隨后采用高糖高脂肪食物飼養(yǎng)2周復(fù)制糖尿病大鼠模型，連續(xù)1周測(cè)量血糖大于16.6mmol/L為造模成功。腦梗死模型制作：將3/0單股尼龍線，置于肝素鈉中浸泡；用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉大鼠，在頸部正中偏右側(cè)行豎直切口，剝離出右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA）；結(jié)扎ECA起始端和CCA近心端，用眼科剪在CCA遠(yuǎn)心端和近心端之間剪一個(gè)小口距離頸總動(dòng)脈分叉5mm，經(jīng)CCA插入3/0尼龍線至大腦中動(dòng)脈起始段，深度為（18.5±0.5）mm；維持體溫（37.0±0.5）℃；用乙醚再次麻醉大鼠，術(shù)后2h把尼龍線輕拔退1cm，作為再灌注0h。正常組不作任何處理；假手術(shù)插線深度為10mm，余同造模大鼠。腦梗死造模死亡率為37%，根據(jù)評(píng)分Berderson（≥1）鑒定造模成功[8]，本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處理方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。模型組、假手術(shù)組、西藥組和中藥組每組隨機(jī)挑選成模的15只大鼠，正常組也隨機(jī)挑選15只正常大鼠進(jìn)行研究。

2.2 藥物干預(yù) 根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，參照陳奇主編《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比計(jì)算，中藥組每日按10.4g/kg體重給予復(fù)元醒腦湯灌胃，西藥組每日以二甲雙胍27mg/kg體重和尼莫地平2.16mg/kg體重灌胃，正常組、假手術(shù)組、模型組均給予等容量的生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)14d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 腦梗死體積測(cè)定 各組大鼠治療14d后用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉（每組7只），放血，打開(kāi)顱骨，取出完整的腦組織，用刀片將腦切成6片2mm左右厚度，用2%TTC染色液37℃中避光染色30min[9]，拍照并用ImageJ軟件分析各組大鼠腦組織梗死體積。

2.3.2 缺血腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察 治療后每組取4只大鼠，深度麻醉后進(jìn)行心臟灌流，斷頭取腦組織。每組2只大鼠進(jìn)行腦組織HE染色，用多聚甲醛（4%）固定，進(jìn)行組織梯度脫水，包埋，病理切片，染色和封片，于正置顯微鏡下觀察并拍照。每組另外2只大鼠進(jìn)行透射電鏡觀察，將大鼠腦組織用2.5%戊二醛固定，樹(shù)脂包埋，超薄切片和染色，于透射電鏡下觀察腦缺血后皮質(zhì)微血管超微結(jié)構(gòu)的改變。

2.3.3 缺血腦組織miR-320基因表達(dá)水平及IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 治療后各組大鼠取3只，用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，快速斷頭冰上取腦，剪開(kāi)顱骨取得腦組織。分離出腦梗死組織（正常組與假手術(shù)組取全腦組織），根據(jù)中心線位置一分為二，一半加入RNA抽提試劑進(jìn)行組織勻漿，并抽提RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR（QPCR）檢測(cè)缺血腦組織miR-320、IGF-1、IGFR和GAPDH的基因表達(dá)水平。引物序列，MiR-320-F：ACACTCCAGCTGGGACTTAAACGTGGTTG TAC；MiR-320-R：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；IGF-1-F：ACTCGATAACTTTGCCAGAAGAG；IGF-1-R：TTCTTGTGTGTCGATAGGGGC；IGF-1R-F：TAGTGGGTGTGTTGCCACC；IGF-1R-R：TCCACCGTGTTGCAAGACTAG；內(nèi) 參 基因GAPDH-F：ACTTTGGCATCGTGGAAGGG；GAPDH-R：TGCAGGGATGATGTTCTGGG。另一半腦梗死組織采用Western方法，加入組織裂解液（RIPA）進(jìn)行腦組織勻漿，離心后（12000r/min，5min）用BCA試劑盒定量蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，4℃孵育一抗（IGF-1、IGF-1R）過(guò)夜，室溫孵育二抗1h，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影檢測(cè)缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)水平[9]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0進(jìn)行分析，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)差異性均以（±s）表示，P＜0.01表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同組之間的比較采用One-ANOVA分析，組內(nèi)比較用LSD方法。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠腦組織梗死體積比較 正常組織被染成紅色，梗死區(qū)域?yàn)樯n白色。從TTC染色圖片中可見(jiàn)，梗死范圍主要位于額葉、頂葉、部分顳葉皮質(zhì)、背側(cè)丘腦、內(nèi)囊和紋狀體等大腦中動(dòng)脈支配區(qū)域，見(jiàn)圖1。正常組和假手術(shù)組大鼠的腦組織無(wú)梗死灶；模型組、西藥組和中藥組均有明顯的腦梗死病灶，其中西藥組和中藥組腦組織的梗死范圍均小于模型組。模型組腦梗死體積（175±19）mm3，西藥組腦梗死體積（148±21）mm3，中藥組腦梗死體積（132±15）mm3，正常組與假手術(shù)組腦梗死體積均為0。各組腦梗死體積比較，模型組和假手術(shù)組比較有極顯著性差異（P＜0.01），中藥組、西藥組大鼠腦梗死體積明顯小于模型組（P＜0.01），中、西藥組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織梗死情況

3.2 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)比較

3.2.1 HE染色 見(jiàn)圖2。正常組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核居中，染色較深，數(shù)量較多，細(xì)胞質(zhì)的染色較為均一，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞變性和壞死的現(xiàn)象。假手術(shù)組出現(xiàn)了細(xì)胞核固縮的現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)染色欠均勻，細(xì)胞有輕微損傷。模型組細(xì)胞之間的間隙增大，排列紊亂，細(xì)胞核固縮、破裂甚至消失，胞漿染色不均一，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，有明顯的細(xì)胞變性和壞死。西藥組和中藥組細(xì)胞排列趨向于規(guī)則、有序，細(xì)胞核固縮和彌散現(xiàn)象減弱，胞漿染色較模型組均勻，細(xì)胞損傷明顯得到改善。

圖2 各組大鼠腦組織病理改變（HE染色，400×）

3.2.2 透射電鏡觀察 見(jiàn)圖3。正常組腦皮質(zhì)微血管的血管壁厚，電鏡下染色深，血管內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接，基底膜緊密連接。假手術(shù)組的血管連接比較緊密，細(xì)胞核染色較深，未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞器損傷。模型組的細(xì)胞連接疏松，血管細(xì)胞壁比較薄，胞核彌散。西藥組、中藥組與模型組相比管壁相對(duì)增粗，血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)水腫減輕，胞核彌散減輕，緊密連接逐漸恢復(fù)規(guī)則化，基底膜疏松減弱。

圖3 各組大鼠腦皮質(zhì)微血管形態(tài)（Bar值為2μm）

3.3 各組大鼠缺血腦組織miR-320、IGF-1、IGF-1R基因表達(dá)水平比較 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組大鼠缺血腦組織miR-320、IGF-1、IGF-1R基因表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)表1。模型組與假手術(shù)組比較miR-320基因的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），IGF-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥組miR-320基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），IGF-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；中藥組、西藥組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?jiàn)缺血腦組織中miR-320表達(dá)上調(diào)，IGF-1的mRNA表達(dá)下調(diào)，而復(fù)元醒腦湯和西藥都能有效調(diào)節(jié)缺血腦組織中的miR-320基因和IGF-1 mRNA表達(dá)，中、西藥效果相近。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血腦組織IGF-1R mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠缺血腦組織miRNA-320、IGF-1、IGF-1R基因表達(dá)水平比較

3.4 各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)水平比較 采用Western blot分析方法檢測(cè)各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖4、表2。模型組IGF-1蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組和正常組（P＜0.01），西藥組和中藥組IGF-1的蛋白表達(dá)水平均顯著高于模型組（P＜0.01），中藥組顯著高于西藥組（P＜0.01）?？梢?jiàn)缺血腦組織中IGF-1蛋白表達(dá)下調(diào)，經(jīng)復(fù)元醒腦湯或西藥治療都能部分恢復(fù)其表達(dá)，中藥的療效顯著優(yōu)于西藥。與假手術(shù)組比較，模型組IGF-1R的蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達(dá)比較

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病是腦梗死的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，糖尿病患者發(fā)生腦梗死的概率是非糖尿病患者的2～4倍。腦梗死發(fā)生的主要原因是動(dòng)脈粥樣硬化，高血糖促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，致使糖尿病患者腦動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率約為70%。此外，高血糖也可導(dǎo)致凝血系統(tǒng)的改變，促進(jìn)血栓形成，引發(fā)并加重動(dòng)脈粥樣硬化。尼莫地平為二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，易透過(guò)血腦屏障，幾乎不影響外周血管，但能高度特異性作用于腦血管，抑制鈣離子進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞，擴(kuò)張腦血管，增加缺血腦組織的血液供應(yīng)。尼莫地平可抑制鈣離子進(jìn)入神經(jīng)元，顯著降低神經(jīng)元游離鈣水平，減輕鈣超負(fù)荷引起的神經(jīng)元毒性損害，可有效地預(yù)防和治療腦血管痙攣引起的缺血性腦神經(jīng)損傷。二甲雙胍具有獨(dú)立于降糖外的血管保護(hù)作用，通過(guò)對(duì)患者糖脂代謝的調(diào)節(jié)，使體內(nèi)游離Ca2+濃度降低，通過(guò)刺激外周組織吸收葡萄糖，舒張血管平滑肌，有效改善胰島素抵抗，并可起到控制血壓的作用。臨床使用二甲雙胍聯(lián)合尼莫地平治療糖尿病腦梗死具有良好的效果。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病并發(fā)腦梗死屬于“消渴并發(fā)中風(fēng)”的范疇，多由元?dú)馓撊?，腎元虧虛，形神俱傷，釀生痰瘀，致瘀阻脈絡(luò)，痰熱生風(fēng)，治療中我們堅(jiān)持以扶持元?dú)鉃橹?，?lián)合逐瘀化痰、泄熱息風(fēng)通絡(luò)，擬復(fù)元醒腦湯。本方可以恢復(fù)機(jī)體平衡，扶正祛邪，使局部及整體的血?dú)庹{(diào)和，治療缺血性中風(fēng)，在減輕腦水腫程度，改善神經(jīng)功能恢復(fù)、胰島素抵抗以及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)等方面取得顯著效果。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)元醒腦湯與西藥都具有良好的腦梗死治療效果，能夠顯著減少腦梗死體積，促進(jìn)腦梗死區(qū)域血管新生和微循環(huán)的作用。機(jī)體在高血糖的狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞中miR-320的表達(dá)顯著增加[10]，IGF-l蛋白由于受miR-320的負(fù)調(diào)控而表達(dá)降低[11]。IGF-1是一種重要的神經(jīng)保護(hù)多肽，IGF-1及其受體均廣泛分布于腦組織[12]，IGF-1在腦組織中的表達(dá)正常對(duì)于缺血腦組織神經(jīng)的恢復(fù)有重要意義[13-14]。本研究結(jié)果表明，復(fù)元醒腦湯和西藥都能顯著提高梗死腦組織中IGF-1的表達(dá)量，顯著降低miR-320基因表達(dá)。

綜上，復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗死模型大鼠腦梗死的改善作用可能與其降低miR-320的表達(dá)同時(shí)促進(jìn)IGF-1的高表達(dá)有關(guān)。本研究豐富了復(fù)元醒腦湯治療糖尿病腦梗死在血管新生方面的機(jī)制，為進(jìn)一步探索糖尿病腦梗死的病理機(jī)制、制定防治策略及新藥研發(fā)提供了一條全新的途徑。

參考文獻(xiàn)

[1]ROGER V L，GO A S，LLOYD-JONES D M，et al.Executive summary：heart disease and stroke statistics—2012 update：a report from the American Heart Association[J].Circulation，2012，125（1）：188.

[2]VAN ROOIJ E.The art of microRNA research[J].Circ Res，2011，108（2）：219.

[3]FENG B，CHAKRABARTI S.miR-320 Regulates Glucose-Induced Gene Expression in Diabetes[J].ISRN Endocrinol，2012：549875.

[4]AL-JAMAL K T，GHERARDINI L，BARDI G，et al.Functional motor recovery from brain ischemic insult by carbon nanotube-mediated siRNA silencing[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（27）：10952.

[5]張丹丹，沈靜，劉芳.微小RNA與糖尿病血管新生[J].國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志，2013，33（1）：40.

[6]沈俊逸，方邦江，凌麗，等.復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗死大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白表達(dá)作用的研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2016，25（8）：1457.

[7]方邦江，周爽，沈俊逸，等.復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗塞大鼠胰島素抵抗干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，7（3）：374.

[8]劉恒濤.地黃飲子治療對(duì)腦缺血大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15（2）：168.

[9]ZHANG L，GENG X，ZHOU J，et al.Fabrication of poly（γ-glutamic acid）-based biopolymer as the targeted drug delivery system with enhanced cytotoxicity to APN/CD13 over-expressed cells[J].J Drug Target，2015，23（5）：453.

[10]YAN H，MITSCHELEN M，TOTH P，et al.Endothelin-1-induced focal cerebral ischemia in the growth hormone/IGF-1 deficient Lewis Dwarf rat[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2014，69（11）：1353.

[11]SHANTIKUMAR S，CAPORALI A，EMANUELI C.Role of microRNAs in diabetes and its cardiovascular complications[J].Cardiovasc Res，2012，93（4）：583.

[12]LI C，CHE L H，SHI L，et al.Suppression of Basic Fibroblast Growth Factor Expression by Antisense Oligonucleotides Inhibits Neural Stem Cell Proliferation and Differentiation in Rat models With Focal Cerebral Infarction[J]. J Cell Biochem，2017，118（11）：3875.

[13]WANG X H，QIAN R Z，ZHANG W，et al.MicroRNA-320 expression in myocardial microvascular endothelial cells and its relationship with insulin-like growth factor-1 in type 2 diabetic rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36（2）：181.

[14]ZHANG L，WANG T，LI Q，et al.Fabrication of novel vesicles of triptolide for antirheumatoid activity with reduced toxicity in vitro and in vivo[J].Int J Nanomedicine，2016，11：2663.