烏金豬mtDNA D-Loop區(qū)的遺傳多樣性*

王志敏，徐亞歐，孫 艷，楊 磊，徐瓏洋，王英明，黃衛(wèi)平

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.凉山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，四川 凉山州 615042)

烏金豬原產(chǎn)于云貴高原，是我國優(yōu)良的地方遺傳資源之一，主要分布在云南、貴州和四川交界的大部分地區(qū).毛色主要有黑色和棕黃色，因產(chǎn)地的不同在各地的叫法也不同.在四川的涼山彝族自治州被稱作涼山豬，主要分布于涼山州的西昌、昭覺和美姑等地.貴州的柯樂豬、威寧豬，云南的大河豬等均屬于烏金豬不同類群.1976年云南、貴州和四川聯(lián)合調(diào)查認(rèn)為，上述不同名稱的豬種屬同種異名，將其統(tǒng)稱為烏金豬.烏金豬具有體型健壯、后驅(qū)發(fā)達(dá)、能適應(yīng)高寒氣候和粗放飼養(yǎng)，適宜高原牧場繁衍，形成了肉質(zhì)鮮嫩，口感好，在云南、貴州和四川的冕寧等地有用做火腿的習(xí)慣[1-3].

對(duì)烏金豬的起源及不同類群的遺傳關(guān)系研究多基于其外貌特征，分布地域，群體變化，生產(chǎn)性能，歷史考證等方法進(jìn)行.利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法對(duì)烏金豬不同類群間的遺傳親緣關(guān)系研究還未見報(bào)道.動(dòng)物mtDNA具有廣泛的種內(nèi)和種間多態(tài)性,且為母性遺傳,在親緣關(guān)系相近的物種間其進(jìn)化速度比核基因快,因而它為種群遺傳學(xué)和進(jìn)化遺傳學(xué)在分子水平上的研究提供了理想的研究對(duì)象.并已廣泛的應(yīng)用于動(dòng)物遺傳學(xué)、遺傳分化、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、原種鑒定、分子生態(tài)學(xué)等方面[4-7].本研究利用mtDNA D-loop的多態(tài)性對(duì)分布于與云南(大河豬)、貴州(柯樂豬)和四川(凉山豬)烏金豬的不同類群的親緣關(guān)系進(jìn)行比較研究，為今后烏金豬不同類群遺傳資源的保護(hù)與開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用烏金豬血液樣本由四川省涼山彝族自治州畜牧科學(xué)研究院提供.選取健康成年烏金豬(不區(qū)分公母)的3個(gè)類群，四川凉山豬27只(昭覺11只，美姑13只，西昌3只)，貴州畢節(jié)地區(qū)柯樂豬21只，云南富源縣大河豬20只.用內(nèi)含EDTA2K抗凝劑的試管自頸靜脈采血，血液樣本低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用.

1.2 主要試劑

2*Tag酶PCR Master Mix、DNase/RNase-free去離子水、D2000 DNA Marker、天根基因組DNA提取試盒和瓊脂糖Agarose，均購自成都康迪生物技術(shù)有限公司.

1.3 基因組DNA的提取及檢測

利用天根生物試劑有限公司離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒，從EDTA抗凝全血中提取基因組DNA.紫外分光光度計(jì)檢測DNA樣品D 260/280值及濃度.配制1.5%瓊脂糖平板凝膠,電泳緩沖液為0.5×TBE,溴化乙錠染色,電壓為120 V,電泳時(shí)間為30 min,凝膠成像系統(tǒng)觀察、保存.

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)豬線粒體DNA序列(AF034253)[8]，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物1，擴(kuò)增片段包括完整的D-loop，引物序列見表1，交由成都擎科梓熙生物有限公司合成.根據(jù)成都擎科梓熙生物有限公司返回的測序結(jié)果運(yùn)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物2對(duì)突變頻率較高的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物送往公司進(jìn)行測序，設(shè)計(jì)引物見表1.

表1 引物信息Table 1 Primer Information

PCR擴(kuò)增體系共50 μL：Taq聚合酶25 μL，ddH2O19 μL，cDNA2 μL，上下游引物各2 μL.PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性(4 min)；94 ℃變性(20 s)，Tm退火(60 s)，72 ℃延伸(90 s)，共39個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸(10 min).取5 μLPCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，將產(chǎn)物送往擎科進(jìn)行測序(1 587 bp產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，472 bp產(chǎn)物進(jìn)行正向測序).

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用vectorNTI軟件對(duì)測定的序列進(jìn)行比對(duì)后截取突變頻率集中的序列,DNAStar軟件統(tǒng)計(jì)截取序列的長度和堿基組成，MEGA Ver5.0 軟件計(jì)算類群間的 Kimura 雙參數(shù)距離[9]并以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ) 構(gòu)建類群間的進(jìn)化樹;并進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)、核苷酸多樣性分析.用clustalw對(duì)序列聚類，用TreeView軟件制作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 mtDNA D-Loop區(qū)及其突變位點(diǎn)富集區(qū)的擴(kuò)增

5個(gè)地區(qū)烏金豬類群完整mtDNA D-loop區(qū)及其突變位點(diǎn)富集片段的PCR擴(kuò)增序列通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，與預(yù)期大小相符，見圖1及圖2.

m— DNA Marker;Z—昭覺烏金豬；M—美姑烏金豬；X—西昌烏金豬；Y—云南烏金豬；G—貴州烏金豬.圖1 5個(gè)類群烏金豬mtDNA D-Loop區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR Amplification Result of mtDNA D-Loop of 5 Wujin Pigs

m—DNA Marker;Z—昭覺烏金豬；M—美姑烏金豬；X—西昌烏金豬；Y—云南烏金豬；G—貴州烏金豬.圖2 5個(gè)類群烏金豬mtDNA D-Loop區(qū)突變富集區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR Amplification Results of mtDNA D-Loop Region Mutation Enrichment Region of 5 Wujin Pigs

2.2 序列的長度與堿基的組成

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往擎科進(jìn)行測序.用vectorNTI軟件對(duì)測定的序列進(jìn)行比對(duì)后截取同源序列，用DNAStar軟件統(tǒng)計(jì)截取序列的長度為249 bp，5個(gè)地區(qū)烏金豬的A，G，T，C堿基含量見表2.

表2 5個(gè)類群烏金豬mtDNA D-Loop區(qū)突變富集區(qū)的堿基頻率Table 2 Base Frequency of the mtDNA D-Loop Region of 5 Wujin Pigs

由表2可知，A，G，T，C堿基的平均為25.81%，25.57%，21.01%和27.61%，且G+C的平均(53.17%)高于A+T的平均(46.83%)，這表明該區(qū)域結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定.

2.3 核苷酸序列多態(tài)性

在測序的烏金豬mtDNA D-loop區(qū)全序列共46個(gè)突變位點(diǎn)，簡約信息位點(diǎn)有5個(gè)，單一多態(tài)位點(diǎn)37個(gè)，其中以A/G突變?yōu)橹?就變異位點(diǎn)而言，貴州及四川類群的變異位點(diǎn)數(shù)較多，而云南的變異較小，其結(jié)果見表3.

表3 核苷酸序列多態(tài)性分布情況Table 3 Nucleotide Sequence Polymorphism Distribution

注：m為分析位點(diǎn)數(shù)；S為變異位點(diǎn)數(shù)；ps=s/m；θ=ps/a1；π為核苷酸多態(tài)性；D為Tajima檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量.

2.4 烏金豬種群間的遺傳距離和進(jìn)化樹的構(gòu)建

用MEGA5.0軟件基于Kimura 雙參數(shù)計(jì)算烏金豬5個(gè)類群間的遺傳距離見表4，并用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹見圖3.

表4 5個(gè)類群烏金豬的種間的平均遺傳距離Table 4 Average Genetic Distance of 5 Wujin Pigs

圖3 基于Kimura 雙參數(shù)遺傳距離的烏金豬類群間的NJ進(jìn)化樹Fig.3 NJ Phylogenetic Tree Based on Kimura's Two-Parameter Genetic Distance Among Wujin Pigs

圖4 5個(gè)地區(qū)烏金豬網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)化Fig.4 Evolution of Wujin Pig Network in Five Areas

表4中貴州烏金豬(柯樂豬)與四川烏金豬(凉山豬)的美姑、昭覺、西昌類群的遺傳距離較大，再由圖3也可看出柯樂豬較四川凉山豬類群距離較遠(yuǎn).云南烏金豬(大河豬)與四川烏金豬(凉山豬)的美姑、昭覺、西昌類群的遺傳距離相對(duì)較小，由圖3可看出大河豬與四川烏金豬(凉山豬)的美姑、昭覺、西昌類群遺傳距離相對(duì)較近.圖3顯示凉山豬的3個(gè)類群(昭覺、美姑、西昌)首先聚為一類，然后四川烏金豬(凉山豬)與云南烏金豬(大河豬)聚為一類，四川烏金豬(凉山豬)與貴州烏金豬(柯樂豬)最后聚類，親緣關(guān)系最遠(yuǎn).

根據(jù)5個(gè)地區(qū)烏金豬的序列，用Clustalx進(jìn)行聚類，再用TreeView制作5個(gè)地區(qū)烏金豬網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)化圖(圖4).由圖4可見所研究的3個(gè)烏金豬類群可以分為2個(gè)大類，貴州烏金豬(柯樂豬)自成一類，云南烏金豬(大河豬)與四川烏金豬(凉山豬)為一個(gè)類群，說明3個(gè)地區(qū)的烏金豬可能有2個(gè)母系起源.且在2個(gè)母系起源的類群中，相互之間也有血緣的交叉.

3 結(jié)論與分析

本研究對(duì)分布于西南地區(qū)云南、貴州和四川的地方豬種烏金豬的mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)主要集中與290 bp的區(qū)段，分析該片段的堿基組成，發(fā)現(xiàn)A+T平均低于G+C平均，說明該區(qū)段結(jié)構(gòu)比穩(wěn)定.并對(duì)該序列進(jìn)行核苷酸多態(tài)性統(tǒng)計(jì)，全序列共46個(gè)突變位點(diǎn)，簡約信息位點(diǎn)有5個(gè)，單一多態(tài)位點(diǎn)37個(gè)，其中以A/G突變?yōu)橹?基于Kimura雙參數(shù)計(jì)算類群間的遺傳距離并構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，由進(jìn)化樹可見四川烏金豬(凉山豬)的3個(gè)類群(昭覺、美姑、西昌)首先聚為一類，然后四川烏金豬(凉山豬)與云南烏金豬(大河豬)聚為一類，最后四川烏金豬(涼山豬)與貴州烏金豬(柯樂豬)聚類.趙思思等[10]對(duì)西南型地方豬品種資源的變化的研究表明，1986年出版的《中國豬品種志》中烏金豬主要包含柯樂豬、威寧豬、大河豬和涼山豬類群，2011年出版的《中國畜禽遺傳資源志——豬志》中，柯樂豬、大河豬、昭通豬和涼山豬統(tǒng)稱為烏金豬.其對(duì)烏金豬的類群做了一定的調(diào)整，從20世紀(jì)80年代到21世紀(jì)初烏金豬的數(shù)量增加了1倍以上.由本研究的結(jié)果顯示，3個(gè)烏金豬類群可以分為2個(gè)母系起源，貴州烏金豬(柯樂豬)自成一類，云南烏金豬(大河豬)與四川烏金豬(凉山豬)為一個(gè)類群，這就從分子水平證實(shí)了大河豬、涼山豬屬同種異名的2個(gè)類群.

郭宏宇等[11]對(duì)貴州省的關(guān)嶺豬、柯樂豬和糯谷豬的研究表明，其中柯樂豬及糯谷豬均屬于烏金豬的地方類群.蘭宏等[12]對(duì)西南地區(qū)家豬和野豬mtDNA遺傳多樣性研究表明，西南地區(qū)的豬起源于一個(gè)共同的祖先，在品種形成的早期可能受到創(chuàng)立者效應(yīng)的制約.如若西南地區(qū)豬起源于一個(gè)共同祖先，那么烏金豬在貴州、四川和云南等地的遺傳關(guān)系就顯而易見，總體而言具有較近的親緣關(guān)系，但由于各地群眾的生產(chǎn)生活方式的不同，經(jīng)過長期的選育由形成了各自的特點(diǎn)，從而滿足當(dāng)?shù)厝藗兊纳钚枰?本研究結(jié)果對(duì)于烏金豬的保種與開發(fā)，尤其是對(duì)四川烏金豬(涼山豬)的保護(hù)與開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，也為四川、云南和貴州各地烏金豬的不同類群的合理利用提供了理論依據(jù).

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃啟昆,王玉嵩,王守信,等.云南省家畜家禽品種志[M].昆明:云南科技出版社,1987:18-23.

[2] 郭海濤，郭成裕，李軍鵬,等.我國地方豬品種——烏金豬的生理特性研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2008(10):17-18.

[3] 國家畜禽遺傳資源委員會(huì).中國畜禽遺傳資源志(豬志)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[4] 楊明生,熊邦喜.動(dòng)物MTDNA的研究及在魚類生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用[J].孝感學(xué)院學(xué)報(bào),2005(3):23-27.

[5] 李洪濤，顧為望，吳清洪,等.實(shí)驗(yàn)用藏豬和巴馬小型豬線粒體DNA控制區(qū)堿基序列比較[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，43(5):933-935.

[6] 汪泰初，劉朝良，肖林珍.線粒體基因組(MTDNA)的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(10):2 068-2 068.

[7] 潘寶平，卜文俊.線粒體基因組的遺傳與進(jìn)化研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào)，2005，40(8):1-3.

[8] 趙興波，李 寧.豬線粒體DNA D-loop PCR-RFLP分析[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998(5):13-17.

[9] 李彬彬，黃培春，鐘復(fù)光.生物學(xué)軟件在線粒體DNA序列多態(tài)性分析中的應(yīng)用[J].生物信息學(xué)，2010，8(2):153-155.

[10] 趙思思，賈 青，胡慧艷,等.西南型地方豬品種資源的變化[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(10):91-94.

[11] 郭宏宇，林家棟.利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析貴州3個(gè)地方豬種的遺傳多樣性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(8):77-80.

[12] 蘭 宏，王 文，施立明.西南地區(qū)家豬和野豬MTDNA遺傳多樣性研究[J].Journal of Geneticss & Sgenomics，1995(1):28-33.