超聲波輔助提取魁蒿總黃酮響應面法優(yōu)化工藝*

張 杉,肖 娟,宋曉慧,熊利芝

(吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000)

自然界中植物含有許多對人類身心有益的活性物質，魁蒿中的黃酮就是其中頗具功效的一種.魁蒿(ArtemisiaprincepsPamp.)，菊科，蒿屬，多年生全國廣布性草本植物.味辛苦，民間常用藥，有止血、消炎等功效，對婦科疾病也有很好的功效[1].適當攝入黃酮能夠降低癌癥、骨質疏松癥[2-3]等疾病的發(fā)病率.目前提取黃酮的方法[4-6]有很多，各有優(yōu)劣.近年來，在植物內含物提取方面，超聲波提取技術的應用越來越廣泛.效率高、不易破壞有效成分[7]是超聲波提取技術的顯著特點，因此運用超聲波技術提取植物內含物可以增大活性物質進入溶劑的速度，既縮短提取時間，又增加提取率.目前，通過超聲波技術提取魁蒿總黃酮還未見報道，本次實驗主要以超聲波技術提取魁蒿總黃酮，以響應面的方法探討并優(yōu)化提取工藝.

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

魁蒿：取樣于吉首大學周邊地區(qū).選取葉片完整的魁蒿，蒸餾水洗凈后晾干，50 ℃烘干，粉粹過40目篩，保存?zhèn)溆?試劑：蘆丁(上海阿拉丁工業(yè)有限公司，純度大于98.0%)；無水乙醇(成都金山化學試劑有限公司，純度大于99.7%)；NaNO2(成都金山化學試劑有限公司，純度大于99.0%)；Al(NO3)3(成都金山化學試劑有限公司，純度大于99.0%)；NaOH(天津石英鐘廠霸州市化工廠，純度大于96.0%).

1.2 儀器

儀器：T6新世紀型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TDZ4型臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司).

2 實驗方法

2.1 標準曲線制作

采用5% NaNO2-10% Al(NO3)3-4% NaOH法[8]制作，得標準曲線方程Y=10.335X-0.003 8，R2=0.999 4.其中：Y為吸光度；X為黃酮質量濃度，單位g·L-1.

2.2 總黃酮的提取

取不同體積分數的乙醇提取劑置于裝有適量樣品的錐形瓶中，于超聲清洗器中提取，離心后取上層清液定容，即得提取液.

2.3 總黃酮的測定

將提取液稀釋數倍，按照標準曲線制作的方法測定，得其吸光度，根據標準曲線方程計算提取液濃度.參照文獻[9]計算魁蒿總黃酮提取率.

2.4 單因素實驗

按次序研究料液比等5個因素對魁蒿總黃酮提取率的影響，實驗內容見表1.

表1 單因素Table 1 Single Factors

2.5 響應面優(yōu)化實驗

從單因素實驗中選取影響較大的因素進行響應面實驗[10]，按DE軟件分析得出最適工藝條件.

2.6 重復驗證實驗

用DE實驗設計軟件分析實驗結果得出最佳工藝，并進行3次平行實驗.

3 結果與討論

3.1 單因素實驗

圖1 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of Ethanol Volume Fraction on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.1 乙醇體積分數對總黃酮提取的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在溫度為55 ℃、功率為200 W、時間為30 min和料液比為1∶20(g∶mL)的條件下，按表1中因素Ⅰ次序依次加入不同體積分數溶劑提取.結果如圖1所示.由圖1可知，在乙醇體積分數大于40%且小于70%時，乙醇體積分數越高，總黃酮提取率越大；但當乙醇體積分數大于70%時，總黃酮提取率降低.這可能是魁蒿總黃酮極性[11]與乙醇體積分數70%的溶液極性接近的原因，因而選體積分數70%的乙醇溶液為魁蒿提取的總黃酮的提取液.

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of Material-to-Liquid Ratio on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.2 料液比對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在溫度55 ℃、功率200 W、時間30 min和乙醇體積分數70%的條件下，按表1中因素Ⅱ次序依次以不同料液比提取.實驗結果如圖2所示.由圖2可知，總黃酮提取率在料液比為1∶20(g∶mL)時提取率最高，在料液比小于1∶20(g∶mL)時呈上升趨勢，此后呈下降趨勢.這可能與促進黃酮析出的質子推動力有關[11]，在料液比為1∶15至1∶20(g∶mL)之間質子推動力較大，因此提取率升高.在料液比低于1∶20(g∶mL)時，總黃酮提取率降低，這可能與提取液中滲透壓有關[12]，由于細胞外料液比下降致使?jié)B透壓降低，從而導致總黃酮析出率下降.

圖3 超聲功率對總黃酮提取的影響Fig.3 Effect of Ultrasonic Power on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.3 提取功率對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在溫度55 ℃、時間30 min、乙醇體積分數70%和料液比為1∶20(g∶mL)的條件下，分別按表1的因素Ⅲ不同水平下依次提取.實驗結果如圖3所示.從圖3可知，總黃酮提取率隨超聲功率的變化趨勢呈單峰狀，于200 W達極大值，左側呈上升趨勢，右側呈下降趨勢.一定功率的超聲波能夠增加魁蒿細胞的破碎程度[13]，增加總黃酮析出率.但總黃酮析出的同時其他物質的析出也增加，因而使細胞內外滲透壓改變，當超聲功率超過一定值時反而使總黃酮析出率降低.

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of Temperature on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.4 提取溫度對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在乙醇體積分數為70%、料液比為1∶20(g∶mL)、時間30 min和超聲功率200 W的條件下，按表1因素Ⅳ的次序提取.實驗結果如圖4所示.由圖4可知，在35～65 ℃之間，溫度升高，總黃酮提取率增大，但溫度高于65 ℃時反而減小.溫度影響細胞的滲透壓和溶質的擴散，在低于最適溫時，溫度的升高能夠提高細胞的滲透壓，加速溶質的擴散[13].本試驗中，在35～65 ℃之間，溫度的升高加速總黃酮的滲透，增加溶解速度，提高析出率.但溫度超過最適溫度65 ℃時，黃酮中某些物質易被氧化[13]，因而降低了提取率.

圖5 時間對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of Time on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.5 提取時間對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在乙醇體積分數為70%、料液比為1∶20(g∶mL)、超聲功率200 W和溫度65 ℃的條件下，分別對魁蒿粉末按表1因素Ⅴ的水平次序提取，測定吸光值并計算提取率.實驗結果如圖5所示.圖5表明，魁蒿總黃酮提取率隨提取時間的延長先升高而后降低；提取40 min時總黃酮提取率達到極大值；提取時間超過40 min后總黃酮提取率隨著提取時間的延長而下降.物質提取過程中，有用物質析出的同時會釋放相關分解酶[13].本實驗中，提取時間超過40 min時，可能某些能夠降解黃酮物質的酶增加，降解了黃酮，總黃酮提取率下降.

3.2 響應面分析

3.2.1 響應面實驗設計表 響應面四因素三水平實驗設計如表2所示.

表2 響應面四因素三水平實驗設計Table 2 Design of 4-Factors and 3-Level Experiment by in Response Surface Methodology

3.2.2 響應面實驗數據結果 以上述各單因素中影響較大的因素作為實驗自變量，魁蒿總黃酮提取率作為實驗因變量，進行響應面優(yōu)化實驗.實驗結果列于表3.

表3 響應面實驗結果Table 3 Experimental Results by Response Surface Methodology

3.2.3 響應面實驗數據方差分析 用DE設計軟件分析表3實驗結果的方差，結果見表4.

表4 方差分析Table 4 Variance Analysis

注：①表示p<0.001極顯著;②表示0.001

方差分析中，失擬項顯著性反應模型選擇是否良好：失擬項顯著表示不能用此模型進行預測，模型選擇有誤，反之則模型選擇良好.[10]

表4中，p模型<0.000 1，說明該模型擬合程度較好，能夠很好地預測本次實驗最佳理論數值.因素平方項A2、B2、C2、D2和單因素項A對總黃酮影響顯示為極顯著，說明其對實驗目標影響極大；單因素項B、C、D和兩因素相互作用項BD、CD顯示顯著，說明其對實驗目標影響較大；AB及AC表現(xiàn)為無顯著性，說明其對響應值影響效果不明顯.從上述對因素影響效果的方差分析可知，魁蒿總黃酮提取率受所選因子影響次序從大到小依次為料液比、超聲功率、提取溫度和提取時間.

經過回歸擬合得出擬合方程[14]:

黃酮提取率/%=2.494+0.041A-0.027B+0.027C-0.024D-0.012AB+0.002AC-0.026AD+0.032BC+0.044BD-0.051CD-0.320A2-0.140B2-0.250C2-0.270D2.

3.2.4 響應面對總黃酮提取影響的曲面分析 交互因素曲面分析如圖6—11所示.

圖6 料液比及溫度對總黃酮提取率的響應曲面Fig.6 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Extraction Temperature

圖7 料液比及時間對總黃酮提取率的響應曲面Fig.7 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Extraction Time

圖8 料液比及功率對總黃酮提取率的響應曲面Fig.8 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Ultrasonic Power

圖9 溫度及時間對總黃酮提取率的響應曲面Fig.9 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Temperature and Time

圖10 溫度及功率對總黃酮提取率的響應曲面Fig.10 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Temperature and Ultrasonic Power

圖11 時間及功率對總黃酮提取率的響應曲面Fig.11 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Time and Ultrasonic Power

響應面的曲面陡峭程度能反映出因素對考察值影響顯著程度，曲面越陡峭代表影響越顯著[15].圖6—11響應曲面顯示，四因素的交互影響[16]中，料液比與時間的共同作用對總黃酮提取率效果相對較小；時間與功率則相較強；其他因素的交互效果均具顯著性差異.結合方差分析可以看出，曲面分析和方差分析沒有顯著差別.

實驗得出理論最優(yōu)條件：乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度和超聲功率分別為70%，1∶20.35(g∶mL)，51 min，65.06 ℃和201.5 W，提取率為2.499%.結合實驗具體情況將條件稍作修改：乙醇體積分數70%、料液比1∶20(g∶mL)、提取時間50 min、提取溫度65 ℃和超聲功率200 W.平行重復實驗結果為2.505%，2.486%和2.488%.總黃酮平均提取率為2.493%.

4 結論

經過超聲波輔助提取以及對實驗結果的方差分析，得出魁蒿總黃酮提取率受所選因子影響次序從大到小依次為：料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間.響應面法分析得出最佳工藝條件為：料液比1∶20(g∶mL)、乙醇體積分數70%、提取時間50 min、提取溫度65 ℃和超聲功率200 W.在此工藝條件下，最大提取率達到2.493%.

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