巴戟天寡糖單體HexB減輕HUVECs缺氧復氧損傷*

宋延明， 馮國清， 李倩倩， 察雪湘

(鄭州大學基礎醫(yī)學院， 河南 鄭州 450001)

心肌缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)指心肌局部缺血后再灌注，心肌功能不僅沒有恢復，反而使得缺血所致?lián)p傷進一步加重的現(xiàn)象[1]。根據(jù)文獻報道，IRI涉及到多種機制[2]，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導的細胞凋亡是其重要機制之一。ERS指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)受到干擾，導致功能異常，最后未折疊和錯誤折疊的蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并伴隨著Ca2+平衡的失調(diào)[3-4]。缺血再灌注損傷、氧化應激或外界壓力負荷增大等刺激都會誘導細胞ERS的產(chǎn)生，從而激活ERS相關凋亡通路[5]。

巴戟天屬草科藤植物，為“四大南藥”之一，具有補腎壯陽和祛風濕的功效。本研究團隊對巴戟天寡糖混合物進行提純得到菊淀粉型聚糖和呋喃糖，并經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天寡糖單體HexB具有促進心臟血管生長作用并可以減輕缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)對血管內(nèi)皮細胞造成的損傷[6-8]，并經(jīng)激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)HexB可結合于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。然而HexB的上述作用是否是通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所產(chǎn)生，尚未經(jīng)實驗證實。

本實驗采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究對象建造H/R模型。CCK-8法檢測細胞的存活率，流式細胞術檢測細胞的凋亡率，Western blot法檢測ERS標志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)、凋亡相關蛋白caspase-12及磷酸化 c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun NH2-terminal kinase，p-JNK)的表達。本實驗中同時利用ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)和ERS誘導劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)作為對照，進一步闡述HexB減輕H/R損傷HUVECs的機制，為以后基于此單體新藥的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞株

HUVECs由鄭州大學生物工程系祁元明教授惠贈。

2 主要試劑和儀器

巴戟天寡糖單體HexB(純度>95%，日本北海道大學姚閔教授協(xié)助提純)；胎牛血清購自四季青生物材料有限公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞凋亡檢測試劑盒購自天津三箭生物技術股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、BCA試劑盒、ECL超敏發(fā)光液和蛋白上樣緩沖液購自Solarbio；TG和4-PBA購自Sigma；蛋白電泳分子量標志物購自Thermo；辣根過氧化酶標記山羊抗兔II 抗購自EarthOx；兔抗人caspase-12多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人CHOP單克隆抗體購自Abcam；兔抗人p-JNK、GAPDH和GRP78單克隆抗體購自CST。

BD Accuri C6型流式細胞分析儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)；酶標儀(Bio-Rad)；倒置顯微鏡(Nikon)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo)；Western blot電泳儀(Bio-Rad)。

3 主要方法

3.1細胞培養(yǎng)及分組 復蘇細胞于培養(yǎng)瓶中，加入4 mL含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取第3～5代生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)的實驗。將細胞分為7組，對照(control)組、HexB組、H/R組、HexB+H/R組、4-PBA+H/R、TG組和HexB+TG。各藥物均于H/R建模前加入細胞預處理：其中HexB(30 nmol/L)預處理24 h、4-PBA(2 mmol/L)預處理12 h、TG(2 μmol/L)預處理24 h。

3.2CCK-8法檢測HUVECs活力 各組細胞以每孔1×104個的密度接種于96孔板上，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，同時設置對照組與空白組，每組8個復孔。細胞處理結束后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑。放入培養(yǎng)箱反應2 h后，用酶標儀在450 nm處檢測吸光度(A)值，細胞存活率(%)=(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%，實驗重復3次。

3.3Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡率 用胰蛋白酶(不含EDTA)消化細胞，然后1 500 r/min離心5 min收集細胞，用PBS漂洗細胞2次，1 500 r/min離心5 min收集細胞于離心管中，然后每管加入500 μL的Binding Buffer重懸細胞后依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶 (propidium iodide，PI)混合均勻，室溫避光反應10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

3.4Western blot檢測GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平 RIPA法裂解細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，于-80 ℃保存。取上述蛋白進行SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用脫脂牛奶在37 ℃搖床上封閉2 h，加入目標蛋白 I 抗和內(nèi)參照GAPDH I 抗，在4 ℃冰箱中過夜孵育，加入辣根過氧化物酶標記 II 抗在37 ℃孵育2 h后，用ECL化學發(fā)光法顯示。檢測條帶灰度值，并計算目標蛋白條帶灰度值與相應GAPDH條帶灰度值之比，實驗重復3次。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，單因素方差分析進行多組間比較，SNK-q法進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組HUVECs活力的分析

與control組相比，H/R組和TG組HUVECs的細胞活力明顯降低(P<0.05)；與H/R組比較，HexB+H/R和4-PBA+H/R組HUVECs的細胞活力明顯升高(P<0.05)；但是HexB+H/R組和4-PBA+H/R組兩組間細胞活力的差異無統(tǒng)計學顯著性；與TG組相比，HexB+TG組的細胞活力亦顯著升高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The viability of HUVECs with different treatments was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group;&P<0.05vsTG group.

圖1CCK-8法檢測各組HUVECs的細胞活力

2 各組HUVECs凋亡率的分析

與control組相比，H/R組和TG組的細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與H/R組相比，HexB+H/R組和4-PBA+H/R組的細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；HexB+H/R組和4-PBA+H/R組細胞凋亡率的差異無統(tǒng)計學顯著性；與TG組相比，HexB+TG組細胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖2。

3 各組GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK蛋白水平的分析

與control組相比，H/R組和TG組的GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，HexB+H/R組和4-PBA+H/R組的GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平明顯降低(P<0.05)；HexB+H/R組和4-PBA+H/R組的GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK蛋白水平的差異無統(tǒng)計學顯著性；與TG組相比，HexB+TG組GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖3。

討 論

缺血再灌注損傷的機制是復雜的，研究發(fā)現(xiàn)其病理學過程涉及到多條凋亡相關信號轉(zhuǎn)導通路，其中，線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑和ERS凋亡途徑被稱為3大凋亡通路[1]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是整合細胞損傷和凋亡信號的重要細胞器[9]，在對細胞凋亡的研究中，ERS在細胞凋亡中所扮演的角色已經(jīng)逐漸清晰[10-11]。與ERS相關的凋亡通路主要有3條：CHOP、JNK以及caspase-12通路[12]。有文獻指出，如果ERS反應持續(xù)時間較長，便會誘發(fā)細胞的凋亡，此時3條細胞凋亡通路即CHOP、JNK以及caspase-12凋亡途徑被激活[13]。其中，CHOP和caspase-12的激活是觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡途徑的特異性信號轉(zhuǎn)導通路[14]。有研究證實通過抑制ERS相關凋亡途徑可抑制H/R所誘導的細胞凋亡[15-16]。Yu等[17]和Gao[1]等通過實驗也進一步證實了上述結果。

那么，HexB是否也是通過抑制ERS途徑減輕H/R誘導HUVECs損傷的呢？本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，HUVECs缺氧復氧后，細胞活力明顯降低，細胞凋亡率顯著升高，ERS相關蛋白GRP78、CHOP、caspase-12和p-JNK表達顯著增加，說明ERS相關凋亡通路被激活并誘導細胞凋亡。

為證實HexB可以通過抑制ERS發(fā)揮保護HUVECs作用，本實驗在TG誘導細胞之前，對細胞進行了HexB的預處理，結果表明，HexB可以顯著抑制TG誘導的細胞凋亡及細胞活力下降，同時降低GRP78、CHOP、caspase-12和p-JNK蛋白表達。為進一步探討HexB抑制ERS相關凋亡途徑的作用，本實驗在細胞缺氧復氧前，對其進行ERS抑制劑4-PBA的預處理，結果表明其可顯著降低缺氧復氧誘導的細胞凋亡，并提高細胞的活力，抑制GRP78、CHOP、caspase-12和p-JNK蛋白表達。

綜上所述，本研究證明HexB可以通過抑制ERS發(fā)揮保護HUVECs的作用，其作用機制與抑制ERS相關的CHOP、caspase-12和JNK凋亡通路有關。

Figure 2. The apoptotic rate of the HUVECs with different treatments anayzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group;&P<0.05vsTG group.

圖2流式細胞術檢測各組HUVECs的凋亡率變化

Figure 3. The protein levels of GRP78, CHOP, caspase-12 and p-JNK in the HUVECs with different treatments determined by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group;&P<0.05vsTG group.

圖3Westernblot檢測各組HUVECs中GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平

[參 考 文 獻]

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