豬瘟病毒E2蛋白在大腸桿菌中的表達及免疫原性分析

王冬雨，魏 薔，劉運超，劉 暢,3，楊 棋，崔穎磊，張改平,4*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002； 3.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012；4.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的高度接觸性傳染病[1]。CSFV屬于黃病毒科(Flaviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，是單股正鏈RNA病毒。基因組長約12.3 kb，僅含1個開放閱讀框(ORF)，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、E1、E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5和NS5B)[2]。其中，E2蛋白是豬瘟的主要保護性抗原，含有約370個氨基酸，其常以同源或異源二聚體形式存在于感染細胞的表面以及病毒粒子的表面，可以刺激豬體內(nèi)產(chǎn)生針對豬瘟病毒的中和抗體，是CSFV吸附和進入敏感細胞的必需蛋白[3]。CSFV中和抗體能夠直接和E2蛋白抗原表位發(fā)生反應(yīng)，阻止CSFV侵入細胞[4]。因此，E2蛋白成為研究各種CSFV基因工程疫苗的首要候選蛋白。

我國因疾病死亡的豬中有30%以上是豬瘟造成的，造成大量的經(jīng)濟損失以及巨大的人力和資源的浪費[5]。規(guī)范豬瘟疫苗接種能有效預(yù)防其發(fā)生，降低發(fā)病率和死亡率，最常用的是豬瘟弱毒疫苗[6]。但近年來，豬瘟發(fā)生情況由大流行轉(zhuǎn)化為無規(guī)律散發(fā)流行，其免疫劑量的增加和免疫頻率的加快，并未能有效及時地控制豬瘟疫情，反而有全國蔓延的趨勢[7-8]。豬瘟兔化弱毒疫苗的普遍使用使得CSFV野毒株及豬瘟兔化弱毒株抗原發(fā)生變異，出現(xiàn)慢性感染、隱性感染等非典型流行形式[9]，很難區(qū)分開豬群中疫苗免疫豬和野毒感染豬，導(dǎo)致疫情難以控制和免疫失敗。因此，研制安全且可以進行鑒別診斷的新型基因工程亞單位疫苗是全世界養(yǎng)豬行業(yè)的迫切需求[10]。

有學(xué)者使用昆蟲表達系統(tǒng)及酵母表達系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)表達[11]，但存在周期長以及成本高、產(chǎn)量低等缺陷。我國學(xué)者涂長春等[12]構(gòu)建了一系列DNA疫苗，動物試驗結(jié)果表明，這些疫苗雖具有一定效果，但免疫效力有待提高。大腸桿菌系統(tǒng)表達目的蛋白具有操作簡單、成本較低而表達量較高等特點。使用大腸桿菌表達E2蛋白，其目的蛋白主要以包涵體形式存在[13-14]，從包涵體獲得目的蛋白需要先將其變性再復(fù)性，過程繁瑣易損耗目的蛋白，降低目的蛋白活性[15]。鑒于此，本研究通過表達條件的優(yōu)化實現(xiàn)E2蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，從而獲得大量具有較高活性的可溶性E2蛋白，最大程度還原目的蛋白天然結(jié)構(gòu)，保持良好的反應(yīng)原性和免疫原性，使用分子篩一步純化有效節(jié)約了純化成本和時間，以期為進一步研究基因工程亞單位疫苗及血清學(xué)診斷等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 pUC57-E2由上海生工生物工程股份有限公司合成；原核表達載體pET-28a、大腸桿菌JM109菌種和BL21(DE3)菌種購自大連寶生物公司；豬瘟HCLV株、豬瘟陽性血清、ST細胞等均由河南省動物免疫學(xué)重點實驗室保存。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ以及T4連接酶、質(zhì)?；厥赵噭┖?、DNA膠回收試劑盒購自大連寶生物公司；IPTG購自北京索萊寶科技公司；羊抗豬IgG-HRP、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司；PG200凝膠層析柱購自GE公司；AEC顯色試劑盒購自中杉金橋公司；納米材料(納米二氧化鈦，nano-TiO2)購自北京德科島金科技有限公司；豬瘟商品疫苗購自廣東永順生物制藥有限公司；gel 01佐劑購自法國SEPPIC公司；弗氏佐劑購自美國Sigma公司。

1.1.3 供試動物 30只6 周齡雌性BALB/C小鼠購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。

1.2 重組表達載體的構(gòu)建

合成pUC57通用引物，上游引入NdeⅠ酶切位點，下游引入XhoⅠ酶切位點，以重組質(zhì)粒pUC57-E2為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后回收，定向插入表達載體pET-28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞后經(jīng)酶切及測序鑒定，將重組質(zhì)粒命名為pET-28a-E2。

1.3 E2蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定

將重組質(zhì)粒pET-28a-E2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，將測序結(jié)果正確的陽性單個菌落按照1︰1 000比例接種在含有100 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600值約為0.6,加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達6 h。收集菌體進行SDS-PAGE及Western blot鑒定。半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L的脫脂奶粉封閉4 ℃過夜，加入400倍稀釋的豬瘟陽性血清作為一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌6次，加入500倍稀釋的羊抗豬IgG-HRP二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗膜后使用AEC顯色液顯色，去離子水終止后觀察特異性條帶。

1.4 E2蛋白的誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體，超聲裂解后12 000 r/min離心30 min，取上清和沉淀，進行 SDS-PAGE電泳。再對誘導(dǎo)表達溫度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化。

1.4.1 誘導(dǎo)溫度 挑取陽性克隆至含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當OD600值為0.6時進行誘導(dǎo)，IPTG終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)溫度分別為18、25、37 ℃，誘導(dǎo)時間為12 h，分別收集3個溫度條件下的菌體，超聲破碎后離心分離上清和沉淀，取樣后進行SDS-PAGE鑒定，確定最佳溫度。

1.4.2 IPTG濃度 挑取陽性克隆至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當OD600值為0.6時，分別加入IPTG，使其終濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L，18 ℃誘導(dǎo)12 h，超聲破碎后分別收集蛋白質(zhì)上清和沉淀，取樣后進行SDS-PAGE鑒定，確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。

1.4.3 誘導(dǎo)時間 挑取陽性克隆至含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當OD600值為0.6時，加入0.1 mmol/L的IPTG，18 ℃進行誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)后12、16、20、24 h收集菌液并進行超聲破碎，之后分離誘導(dǎo)蛋白上清和沉淀，分別進行SDS-PAGE鑒定，確定最佳誘導(dǎo)時間。

1.5 E2蛋白的純化和鑒定

在IPTG終濃度為0.1 mmol/L時，18 ℃誘導(dǎo)16 h后，收集培養(yǎng)后的菌液8 000 r/min離心5 min，棄去上清收集菌體，菌體用Tris-HCl(pH=7)平衡液重懸，超聲波破碎后4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min，收集蛋白質(zhì)上清。將5 mL樣品載入PG200凝膠層析柱進行凝膠過濾分析，流速為0.5 mL/min，收集蛋白質(zhì)組分，以豬瘟陽性血清為一抗、羊抗豬IgG-HRP為二抗進行Western blot鑒定。

1.6 E2蛋白活性檢測

將經(jīng)分子篩純化過的重組蛋白包被酶標板，50 g/L的脫脂奶粉封閉。加入倍比稀釋的豬瘟陽性血清，同時設(shè)置陰性血清對照，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌6次，加入1 000倍稀釋的羊抗豬IgG-HRP，37 ℃孵育45 min，PBST洗滌6次，顯色后測定OD450值，分析目的蛋白的活性。

1.7 動物試驗

將30只BALB/C小鼠隨機分成5組，每組6只。A組：Tris-HCl陰性對照組； B組：陽性對照組，1/10頭劑量的豬瘟商品疫苗；C組：E2蛋白加弗氏佐劑；D組：E2蛋白加弗氏佐劑加納米材料；E組：E2蛋白加gel 01佐劑。分別采用皮下注射的方式進行免疫，在第1天進行一免和第28天進行二免，每7 d進行尾緣靜脈采血。

1.8 中和抗體試驗

采用免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)檢測小鼠血清豬瘟中和抗體水平。豬瘟HCLV株在ST細胞中培養(yǎng)3代使其毒力返強。血清用DMEM倍比稀釋，加入等體積100TCID50病毒，37 ℃溫箱中孵育1 h。PK-15細胞長至50%時棄上清加入血清病毒混合液，37 ℃孵育48 h；每孔加入100 μL預(yù)冷的無水乙醇-20 ℃固定30 min，棄去乙醇，用5%的脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，PBST清洗5次；加入400倍稀釋的豬瘟陽性血清作為一抗，37 ℃孵育1 h，PBST清洗5次；加入500倍稀釋的羊抗豬IgG-HRP作為二抗，37 ℃孵育1 h，PBST清洗5次；每孔加入70 μL的AEC顯色液，通過熒光顯微鏡觀測細胞，計算豬瘟特異性中和抗體滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-28a-E2重組載體的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pUC57-E2為模板進行PCR擴增，得到大小約為1 580 bp的目的片段。目的片段與載體pET-28a經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，連接后轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞，挑取單克隆，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，得到載體(約5 800 bp)和目的基因(約1 580 bp)2個片段(圖1)。將鑒定的陽性克隆進行測序，結(jié)果表明，克隆得到閱讀框序列正確的重組質(zhì)粒pET-28a-E2。

M.DL2000 DNA Marker; 1.酶切產(chǎn)物圖1 重組表達質(zhì)粒pET-28a-E2酶切鑒定結(jié)果

2.2 E2蛋白的誘導(dǎo)表達結(jié)果

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在IPTG濃度為0.1 mmol/L的條件下誘導(dǎo)表達E2蛋白，收集菌液進行SDS-PAGE檢測，在分子質(zhì)量約63 ku處有明顯可見的表達條帶(圖2)，與E2蛋白預(yù)期大小一致。以豬瘟陽性血清為一抗、以羊抗豬IgG-HRP為二抗對表達產(chǎn)物進行Western blot鑒定，結(jié)果顯示，63 ku處表達條帶能夠被豬瘟陽性血清識別，表明該條帶為E2蛋白條帶，E2蛋白在大腸桿菌中成功表達(圖3)。

M.蛋白質(zhì)Marker;1.誘導(dǎo)前菌液;2.IPTG誘導(dǎo)菌液圖2 E2蛋白誘導(dǎo)表達結(jié)果

M.蛋白質(zhì)Marker;1.誘導(dǎo)前菌液;2.IPTG誘導(dǎo)菌液圖3 E2蛋白Western blot分析結(jié)果

2.3 E2蛋白誘導(dǎo)表達優(yōu)化結(jié)果

對轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的BL21(DE3)陽性克隆菌進行誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化，IPTG終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時間12 h，誘導(dǎo)溫度分別為18、25、37 ℃，收集菌體超聲后進行SDS-PAGE，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，上清中目的蛋白的含量減少，誘導(dǎo)溫度在18 ℃時E2蛋白在上清中的含量最高(圖4)。故選擇18 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

M.蛋白質(zhì)Marker;1—6分別為在18、25、37 ℃誘導(dǎo)pET-28a-E2表達的菌體超聲破碎上清和沉淀圖4 E2蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化結(jié)果

18 ℃條件下，誘導(dǎo)時間12 h，IPTG濃度0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L，收集菌體超聲后進行SDS-PAGE，結(jié)果顯示，隨著IPTG濃度的增加，E2蛋白表達量以及在上清中的含量并無明顯變化(圖5)。故選擇IPTG濃度0.1 mmol/L為最佳誘導(dǎo)濃度。

M．蛋白質(zhì)Marker；1—8分別為IPTG濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L時pET-28a-E2誘導(dǎo)表達的菌體超聲破碎上清和沉淀圖5 E2蛋白誘導(dǎo)IPTG濃度優(yōu)化結(jié)果

IPTG濃度為0.1 mmol/L，18 ℃條件下分別誘導(dǎo)12、16、20、24 h，收集菌體超聲后進行SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時間延長，上清中E2蛋白含量增加，在誘導(dǎo)時間為16 h時上清中E2蛋白的含量達到最高，之后隨時間延長，E2蛋白含量減少(圖6)。故選擇16 h為最佳誘導(dǎo)時間。

M．蛋白質(zhì)Marker；1—8分別為誘導(dǎo)時間為12、16、20、24 h的pET-28a-E2誘導(dǎo)表達菌體超聲破碎上清和沉淀圖6 E2蛋白誘導(dǎo)時間優(yōu)化結(jié)果

2.4 E2蛋白的純化和鑒定結(jié)果

E2蛋白純化結(jié)果顯示，經(jīng)過凝膠過濾層析純化后，雜蛋白得到有效的去除，E2蛋白純度達到80%以上(圖7)。以豬瘟陽性血清作為一抗，以羊抗豬IgG-HRP為二抗進行Western blot鑒定，結(jié)果表明，純化的E2蛋白可以被豬瘟陽性血清特異性識別(圖8)。

M．蛋白質(zhì)Marker；1.E2蛋白純化前上清;2.E2蛋白純化后上清圖7 E2蛋白純化結(jié)果

M．蛋白質(zhì)Marker；1.誘導(dǎo)前菌液；2.E2蛋白純化后上清圖8 純化E2蛋白Western blot鑒定結(jié)果

2.5 E2蛋白活性檢測結(jié)果

將純化后的E2蛋白以2 μg/孔的量包被酶標板，檢測重組蛋白的活性。隨著血清稀釋度的增加，OD值呈下降趨勢，當血清1∶3 200稀釋時，陽性值仍在陰性值2.1倍以上(圖9)，表明純化所得E2蛋白活性良好。

圖9 E2蛋白活性檢測結(jié)果

2.6 E2蛋白免疫原性檢測結(jié)果

第1天和第28天對供試鼠分組進行免疫，并將每周采集的血清進行中和抗體檢測。結(jié)果顯示，Tris-HCl組未檢測到中和抗體，3種不同佐劑組均能檢測到中和抗體，E2加弗氏佐劑及納米材料組中和抗體滴度最高，效果最佳，并在一免后56 d達到峰值(圖10)?？梢?，純化后的E2蛋白免疫原性良好。

圖10 E2蛋白免疫原性檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

雖然豬瘟弱毒苗在世界范圍內(nèi)已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但豬瘟疫情仍有發(fā)生[16]。近年來，豬瘟弱毒苗免疫失敗的報道頻率持續(xù)增加，不當?shù)拿庖哌M度導(dǎo)致母源抗體干擾和免疫耐受造成豬瘟疫情的發(fā)生[17-18]，以福建省福安縣甘棠公社為例，全公社共發(fā)生豬瘟482頭，患豬均經(jīng)豬瘟兔化弱毒苗免疫[19]。此外，自然感染的毒株和接種疫苗感染的毒株是很難區(qū)分的，這些問題導(dǎo)致目前可用的減毒疫苗急需優(yōu)化[20]。

E2亞單位疫苗具有安全性高、穩(wěn)定性強的特點，是新型豬瘟疫苗的重點研究方向。E2蛋白是豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白中最主要的保護性抗原[21-22]，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，已成為研究豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗的重要標靶[23]。前人用畢赤酵母表達系統(tǒng)、桿狀病毒系統(tǒng)表達豬瘟E2蛋白，與豬瘟陽性血清均有反應(yīng)，但效果均明顯弱于C株弱毒苗。大腸桿菌遺傳背景清晰，表達蛋白質(zhì)具有操作簡單方便、研究周期短、易于純化、表達量高等特點[24]，并且大腸桿菌表達系統(tǒng)對于蛋白質(zhì)的分析和表達的干擾很少，是工業(yè)生產(chǎn)中比較理想的表達方式[25]。周景明等[26]在大腸桿菌中表達E2蛋白，但表達的E2蛋白均以包涵體形式存在，通過變性和復(fù)性則會損失大量目的蛋白和破壞蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)。本研究將pET-28a-E2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達，通過對誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化，成功實現(xiàn)E2蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，最大程度還原了蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)。

傳統(tǒng)純化E2蛋白多采用Ni柱或陰陽離子交換柱，純化中存在樣品回收率和試驗重復(fù)率不高等不利因素。本試驗采用凝膠過濾層析純化目的蛋白，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩作用，根據(jù)被分離的蛋白質(zhì)大小不同有效進行分離。凝膠過濾層析具有樣品回收率高、試驗重復(fù)率高和操作簡便等多種優(yōu)勢，可以高效穩(wěn)定地分離出目的蛋白。此外，本試驗采用分子篩一步純化得到純度較高的E2蛋白，大大簡化了純化過程。

此前有研究表明，納米二氧化鈦作為一種典型的低毒納米材料，對主要免疫細胞顯示出免疫調(diào)節(jié)作用，其能刺激免疫細胞釋放更多細胞因子，顯著增強免疫反應(yīng)[27-28]。本試驗將大腸桿菌表達的E2蛋白與納米二氧化鈦材料和弗氏佐劑結(jié)合制成的基因工程亞單位疫苗進行動物試驗，發(fā)現(xiàn)其具有良好的免疫原性。

豬瘟弱毒疫苗在我國應(yīng)用廣泛，其毒力返強現(xiàn)象客觀存在，新型基因工程亞單位疫苗將有效解決這一問題。本研究利用大腸桿菌成功表達了可溶性良好的E2蛋白，且經(jīng)過純化的E2蛋白能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的中和抗體，免疫原性良好，為下一步進行豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗的研制和診斷方法建立奠定了基礎(chǔ)。

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