1株高效溶磷細菌的分離、鑒定和溶磷能力研究

屈建航，張璐潔，符運會，李海峰，田海龍

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

土壤中磷元素對植物的生長至關(guān)重要，但土壤中能被植物體直接吸收利用的可溶性磷含量較低[1]，而具有溶磷能力的微生物能夠?qū)⑼寥乐械碾y溶性磷轉(zhuǎn)化為生物有效磷，從而改善土壤的磷源結(jié)構(gòu)，提高作物產(chǎn)量[2]。溶磷微生物目前報道的包括溶磷細菌、真菌和放線菌，其中以細菌居多，主要涉及芽孢桿菌屬(Bacillus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，還有一些如沙雷氏菌屬(Serratia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwiia)等[3-4]。目前，國內(nèi)對無機磷降解菌的研究已有很多報道，尤其是利用溶磷菌促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面。馮瑞章等[5]在土壤中施用溶磷菌制成的菌劑后發(fā)現(xiàn)，菌劑能顯著提高燕麥地下生物量，最大增長率高達336.51%。南京林業(yè)大學(xué)[6]從江西省南昌市林業(yè)科學(xué)院中國楓香根際土壤中分離得到的1株高效溶磷脂的蠟狀芽孢桿菌可明顯促進中國楓香苗的生長，接種90 d，苗高增長率達37.80%，地徑增長率達32.09%。苑偉偉等[7]從青島蔚藍生物研發(fā)中心得到溶磷菌和促生菌配制的一種高效溶磷菌復(fù)合菌劑，其能使土壤有效磷含量提高66.50%，油菜鮮質(zhì)量提高30.76%。穩(wěn)定、高效的溶磷菌種篩選，仍然是溶磷微生物菌劑研制和保護土壤、實現(xiàn)綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要前提。傳統(tǒng)的溶磷細菌多分離自土壤，而水體尤其是富營養(yǎng)化水體的沉積物是微生物天然的種質(zhì)資源庫，含有豐富的微生物多樣性及未培養(yǎng)菌屬[8]，其中溶磷微生物分布亦十分豐富。本研究從太湖表層沉積物中篩選高效溶磷細菌，鑒定并完成溶磷能力測定，為溶磷微生物菌劑的研制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 2011年3月用抓土漏斗法采集太湖污染較嚴重的16個位點表層沉積物，采集后置冰盒帶回實驗室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機磷培養(yǎng)基參考李文紅等[9]的方法：葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)210 g、蒸餾水1 000 mL，pH值 7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min；其中Ca3(PO4)2單獨滅菌，使用前添加。固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、水1 000 mL，pH值 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min，用于菌株的活化和保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶磷菌分離 取5 g沉積物樣品、19 mL鈉型離子交換樹脂、30 mL的1 g/L脫氧膽酸鈉和2.5 g玻璃珠(直徑0.5 mm)，在4 ℃條件下低速振蕩 2 h，靜止1 h后，取上層菌懸液[10]。常規(guī)10倍梯度稀釋法涂布無機磷培養(yǎng)基平板，定期觀察菌落及透明圈形成情況，記錄圈徑比[11]，挑取圈徑比較大的菌落，純化并保藏于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種分類地位鑒定 參考東秀珠等[12]的方法完成基礎(chǔ)生理生化指標的鑒定，并結(jié)合基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析[13]，對溶磷菌株進行系統(tǒng)分類地位鑒定。用無菌牙簽挑取少量單菌落，堿提法制備DNA模板，同時以1.5 μL無菌水為模板作為陰性對照。以16S rRNA基因通用引物Escherichiacoli27f和1495r進行PCR擴增：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，送上海生工生物工程有限公司完成核苷酸序列測定。測序結(jié)果于GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST比對分析[14]，下載相關(guān)序列并以MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.2.3 溶磷能力測定 新鮮菌液定量接種于100 mL無菌無機磷培養(yǎng)基，160 r/min、28 ℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)5 d，設(shè)置3組平行。定期取培養(yǎng)液，3 000 r/min離心30 min，取上清液，使用鉬藍比色法測定磷含量[16]；以無菌培養(yǎng)液代替菌液，設(shè)置空白對照，消除體系影響。使用PHS-3C酸度計，測定培養(yǎng)液的pH值變化。

1.2.4 對土壤溶磷效果的測定 供試土壤采集自鄭州市郊區(qū)農(nóng)田，采樣深度0～20 cm，采集后除雜。30 g土壤加入90 mL無菌水。接種溶磷菌液10 mL，同時以接種10 mL滅活菌液作為平行對照組。25 ℃條件下靜置，在預(yù)定時間點取上清液，鉬藍比色法測定其中可溶性有效磷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌株初篩結(jié)果

不定期觀察涂布的無機磷平板，結(jié)果表明，太湖沉積物中溶磷細菌含量豐富，約為2.40×104cfu/g，從中共初篩到8株具有溶磷能力的菌株。其中，HXZ-21-Ⅲ具有最大的圈徑比，培養(yǎng)4 d時的圈徑比為3.59，選擇其作為本研究的出發(fā)菌株。點接于無機磷平板，培養(yǎng)7 d時的溶磷圈結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株HXZ-21-Ⅲ及其溶磷圈

2.2 溶磷菌株HXZ-21-Ⅲ系統(tǒng)發(fā)育鑒定結(jié)果

生理生化鑒定結(jié)果表明，菌株HXZ-21-Ⅲ菌落呈乳白色，表面光滑，革蘭氏染色陰性，接觸酶反應(yīng)陽性，氧化酶反應(yīng)陽性，甲基紅反應(yīng)陰性。PCR擴增菌株HXZ-21-Ⅲ的16S rRNA基因片段，并測定核苷酸序列，提交GenBank，登錄號為JX857813。完成BLAST比對并下載相關(guān)序列，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株HXZ-21-Ⅲ的16S rRNA基因與Burkholderiafungorum(BAYC01000104)[17]和Burkholderiainsulsa(KF733462)[18]同源性最高，分別為99.08%和98.87%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果(圖2)顯示，菌株HXZ-21-Ⅲ與相關(guān)菌種B.fungorum和B.insulsa的模式株聚在1個分支，表明菌株HXZ-21-Ⅲ為伯克氏菌(Burkholderiasp.)。

以Burknolderia andropogonis ICMP2807T為外圍

2.3 溶磷菌株HXZ-21-Ⅲ的溶磷曲線

菌株HXZ-21-Ⅲ的溶磷曲線如圖3所示，結(jié)果表明，無機磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h時，溶磷量達最高，為16.6 μmol/mL，曲線呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而培養(yǎng)液中的pH值變化趨勢剛好相反，在菌體溶磷量上升的過程中，pH值處于下降趨勢，在最高溶磷量時，pH值達到最低點(3.5)，之后逐漸上升至5左右。

圖3 菌株HXZ-21-Ⅲ的溶磷量及pH值變化曲線

2.4 溶磷菌株HXZ-21-Ⅲ對土壤磷的溶出能力

以土壤作為磷源，磷溶出結(jié)果如圖4所示，相對于對照組，菌株HXZ-21-Ⅲ能明顯提高土壤中磷的溶出效果，在48 h時達到最大溶出量，對應(yīng)體系中可溶性磷含量為0.47 μmol/mL，較對照(0.25 μmol/

圖4 菌株HXZ-21-Ⅲ對土壤磷的溶出效果

mL)高0.22 μmol/mL。

3 結(jié)論與討論

磷是DNA、RNA、ATP和磷酸類脂等生命大分子的重要組成部分，也是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)[19]，土壤中磷含量是土壤肥力的最重要的限制性因素之一[20]。溶磷微生物能溶出不溶性礦物磷，提高土壤磷肥力[21]。一般認為，施用溶磷微生物肥料能夠緩解長期施用化學(xué)肥料引起的土壤退化、板結(jié)等問題[22]，而高效、穩(wěn)定的溶磷菌株的獲取，是構(gòu)建微生物磷肥的關(guān)鍵。1908年首次發(fā)現(xiàn)溶磷微生物的存在，1935年前蘇聯(lián)研究者從土壤中分離到的芽孢桿菌，使土壤中P2O5形式的磷含量提高15%以上，并在1947年大量使用[23]。國內(nèi)對溶磷微生物的研究起步較晚，1955年陳延偉[24]發(fā)現(xiàn)1株具有較強溶解磷酸三鈣能力的無孢子桿菌，可使玉米干質(zhì)量提高32%～45%，谷子的干質(zhì)量提高51%。1993年劉榮昌等[25]分離出歐文氏菌屬的溶磷細菌，制成菌劑施入土壤，使小麥增產(chǎn)10.4%，綠豆增產(chǎn)23.8%。近年來，國內(nèi)溶磷細菌的溶磷能力可達190～663 mg/L[26]。

溶磷微生物的作用機制主要包括有機酸的產(chǎn)生、質(zhì)子的釋放和酸性磷酸酶的生物合成[27]。一般認為，溶磷菌的溶無機磷能力主要取決于其分泌有機酸的能力，有機酸可使培養(yǎng)液的pH值下降，與鐵、鈣、鎂、鋁等金屬離子形成絡(luò)合物，使難溶性磷酸鹽中的磷釋放[28]。本研究中，菌株的溶磷能力與pH值呈負相關(guān)，這與多數(shù)研究報道結(jié)果[29-31]一致，但與部分報道[32-33]有所不同，原因可能是不同菌種的溶磷微生物的溶磷作用機制不同。此外，菌株HXZ-21-Ⅲ為伯克氏菌，而伯克氏菌可利用葡萄糖為碳源產(chǎn)生乙酸和葡萄糖酸，使酸度提高，pH值下降，從而溶解環(huán)境中的不溶性磷[34]。目前，溶磷微生物菌株大多分離自土壤樣品，而水體沉積物是一種新型微生物種質(zhì)資源庫，具備較好的待發(fā)掘前景。宋煒等[35]對太湖沉積物中溶磷細菌分布及其與堿性磷酸酶活性的關(guān)系進行研究發(fā)現(xiàn)，溶磷菌在秋季種類最多，冬季最少，溶磷能力較強的菌株大部分出現(xiàn)在夏季。此外，不同的土壤中溶磷微生物數(shù)量不同，一般為：黑鈣土>黃棕壤>白土>紅壤>磚紅壤>瓦堿土，因為溶磷菌在土壤中的數(shù)量及生態(tài)分布主要受土壤質(zhì)地、有機質(zhì)含量、土壤類型、耕作栽培方式的影響[36]，因此，新型生態(tài)環(huán)境更加有利于溶磷微生物的開發(fā)利用。

本研究自太湖沉積物分離到1株高效溶磷細菌HXZ-21-Ⅲ，經(jīng)鑒定為伯克氏菌，實驗室條件下溶磷能力為16.6 μmol/mL，能有效提高土壤磷的溶出效率。當前國內(nèi)外研究并應(yīng)用于微生物肥料生產(chǎn)的溶磷細菌菌株主要是芽孢桿菌[22]，伯克氏菌在農(nóng)業(yè)上作為生物降解、控制及促進植物生長的根際微生物[37]，為溶磷菌株HXZ-21-Ⅲ的實踐應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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