美洲鰣雄性生殖細(xì)胞冷凍保存及移植

吳栩靈 洪孝友 李凱彬 朱新平 徐紅艷

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所， 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510380；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

生殖細(xì)胞是生物體中攜帶物種遺傳信息并能傳遞到子代的一類細(xì)胞。其中， 原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells， PGCs)、精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells， SSCs)等都具有一定的細(xì)胞全能性， 既能增殖， 也可進(jìn)一步分化而產(chǎn)生配子。因此， 一直以來關(guān)于生殖細(xì)胞的培養(yǎng)、基因編輯及移植等技術(shù)的研究發(fā)展應(yīng)用備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，而且生殖細(xì)胞相關(guān)的操作技術(shù)在鼠(Mus musculus)、雞(Gallus domesticus)及某些模式生物中得到了充足的發(fā)展與應(yīng)用[1，2]。然而， 生殖細(xì)胞的培養(yǎng)及移植等技術(shù)研究在經(jīng)濟(jì)魚類中的發(fā)展應(yīng)用， 還需要大量的探索； 另一方面， 經(jīng)濟(jì)魚類， 特別是一些大型名貴魚類的組織材料來源嚴(yán)重稀缺， 阻礙了這些物種生殖細(xì)胞相關(guān)研究工作的開展。由此可見， 高效的生殖細(xì)胞凍存技術(shù)， 是進(jìn)一步開展水產(chǎn)動(dòng)物生殖細(xì)胞工程育種研究的細(xì)胞資源保障和技術(shù)基礎(chǔ)， 同時(shí)也是建立物種資源庫(kù)最直接有效的方法。

目前， 在魚類、鳥類及哺乳動(dòng)物中都有不少關(guān)于生殖細(xì)胞凍存的研究[3—5]。國(guó)外學(xué)者對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[6，7]、西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[8]、細(xì)鱗鮭(Brachymystax lenok)[9]等魚類生殖細(xì)胞的凍存進(jìn)行了相關(guān)研究。國(guó)內(nèi)研究人員主要進(jìn)行了魚類精子的冷凍保存研究， 如花鱸(Lateolabrax maculatus)[10]、黃姑魚(Nibea albiflora)[11]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[12]等魚類精子的冷凍保存； 也有學(xué)者對(duì)達(dá)氏鱘(Acipenser dabryanus)的精巢細(xì)胞[13]和草魚(Ctenopharyngodon idellus)性腺細(xì)胞[14]進(jìn)行了冷凍保存分析， 并取得了一定的研究進(jìn)展。迄今為止， 關(guān)于細(xì)胞凍存的研究主要是對(duì)分離細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的冷凍保存分析。而最近，Lee等[6]首次將虹鱒的整個(gè)精巢組織進(jìn)行了冷凍保存， 發(fā)現(xiàn)凍存的A型精原干細(xì)胞(Type A spermatogonia， ASGs)在凍存728d后仍能具有細(xì)胞活力。而且有學(xué)者將西伯利亞鱘早期生殖細(xì)胞凍存復(fù)蘇后移植到西德鱘(Acipenser ruthenus)體內(nèi)， 在移植后90d發(fā)現(xiàn)受體中的供體細(xì)胞成功增殖， 證明長(zhǎng)時(shí)間凍存的生殖細(xì)胞仍具有分裂增殖活性， 可用于細(xì)胞移植研究[8]?？傊?， 生殖細(xì)胞凍存技術(shù)無論在物種資源保護(hù)， 還是在生物遺傳育種研究中均具有非凡的意義。特別是在野生資源的采集過程中， 獲得的樣品非常隨機(jī)， 性成熟或性未成熟個(gè)體都有可能，如果能研發(fā)一種操作簡(jiǎn)單且能同時(shí)保存精原干細(xì)胞和精子的冷凍保存技術(shù)， 將對(duì)野生物種資源的保護(hù)更具實(shí)踐意義。

美洲鰣(American shad，Alosa sapidissima)， 隸屬于鯡形總目(Clupeomorpha)、鯡形目(Clupeiformes)、鯡科(Clupeidae)、鰣亞科(Alosinae)、西鯡屬(Alosa)。美洲鰣是溯河產(chǎn)卵洄游性魚類的典型代表， 原本分布于加拿大的圣勞倫斯海灣(Gulf of St. Lawrence)到的美國(guó)佛羅里達(dá)州的約翰河(St.Johns River)一帶的河流和海洋， 其后被各地廣泛引種[15，16]。在21世紀(jì)初期， 美洲鰣引種到中國(guó)， 隨后其人工繁殖得到迅速發(fā)展[17]。美洲鰣與中國(guó)鰣魚(Macrura reevesiiRichardson)同屬鰣亞科， 兩者除了外形相似， 在營(yíng)養(yǎng)組成和口感風(fēng)味上也接近， 因此美洲鰣成為中國(guó)鰣魚的良好替代養(yǎng)殖對(duì)象。自美洲鰣引入我國(guó)以來， 不少學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究，包括生物學(xué)特征[18]、早期發(fā)育[19]、人工繁殖[20]、養(yǎng)殖[21]及應(yīng)激反應(yīng)[22]等， 但研究工作僅限于組織學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)水平， 而分子細(xì)胞水平的生殖生理學(xué)研究還非常欠缺。更重要的是， 美洲鰣是溯河產(chǎn)卵洄游性魚類的典型代表之一， 其采取一年一次產(chǎn)卵繁殖或一年多次產(chǎn)卵繁殖等多種生殖繁育策略， 為解析生殖細(xì)胞在魚類洄游過程中的發(fā)育、分化及成熟等提供了獨(dú)特的研究模型。

因此， 本研究主要進(jìn)行了美洲鰣雄性生殖細(xì)胞的冷凍保存研究。對(duì)美洲鰣精巢組織或分離細(xì)胞進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的冷凍保存， 然后快速解凍復(fù)蘇并統(tǒng)計(jì)各期生殖細(xì)胞的存活率； 同時(shí)， 將凍存復(fù)蘇后的美洲鰣生殖細(xì)胞進(jìn)行了異種移植分析: 組織塊凍存復(fù)蘇后， 分離得到的細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記后移植到斑馬魚(Danio rerio)仔魚中， 以進(jìn)一步檢驗(yàn)凍存生殖細(xì)胞的活性。本研究結(jié)果為美洲鰣及其他洄游性魚類的生殖細(xì)胞培養(yǎng)和應(yīng)用研究提供了前期基礎(chǔ)， 為將來進(jìn)行魚類種質(zhì)資源的保護(hù)研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用的美洲鰣均采自深圳市東方?？萍加邢薰镜拿乐搛堭B(yǎng)殖場(chǎng)。于2016年7月取2齡美洲鰣雄魚4條， 體重580.0—628.0 g。從泄殖腔剪開美洲鰣腹部， 采集精巢組織， 用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered solution， PBS)稍微清洗， 然后放入含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum， FBS)的PBS中，將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行后續(xù)處理。細(xì)胞移植的受體為轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(nano3:yfp)(未發(fā)表數(shù)據(jù))，其PGCs盡管用黃色熒光蛋白標(biāo)記， 但仍可用綠色熒光波長(zhǎng)觀察， 因此本研究用綠色熒光觀察拍照，PGCs標(biāo)記信號(hào)呈綠色。斑馬魚在正常條件下飼養(yǎng)，產(chǎn)卵后收集胚胎孵化， 孵化出苗后第1天(1 dph，days post hatching)即用作細(xì)胞移植受體。實(shí)驗(yàn)所用試劑有PI碘化丙啶(Life)， Hoechst33342(MP Biomedicals)， 細(xì)胞篩(BD-Falcon)， 胎牛血清和DMEM購(gòu)自Gibco公司， 二甲基亞砜DMSO、PKH26試劑盒購(gòu)自Sigma公司， 膠原酶I及胰酶均購(gòu)自Worthington公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分離細(xì)胞凍存將所取精巢組織剪碎后， 用1 mg/mL膠原酶I， 28℃水浴消化約30min， 加0.25%胰酶繼續(xù)消化約30min。加入1/10體積牛血清終止消化反應(yīng)， 用細(xì)胞篩過濾并收集細(xì)胞， 然后用凍存液重懸細(xì)胞并凍存管分裝， 慢速降溫至–80℃保存1—2d， 然后將樣品轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

組織塊凍存所取精巢組織剪碎至1 mm3左右， 離心去上清， 凍存液重懸組織， 凍存管分裝及凍存(方法同上)。

樣品復(fù)蘇樣品凍存250d后， 從液氮中取出并迅速轉(zhuǎn)移到37℃中水浴進(jìn)行解凍復(fù)蘇。細(xì)胞或組織凍存樣品離心后用PBS清洗2遍， 用DMEM重懸備用。凍存復(fù)蘇的組織塊用胰酶/膠原酶消化解離成單個(gè)細(xì)胞， PBS清洗1遍， 用DMEM重懸細(xì)胞備用。

細(xì)胞存活率檢測(cè)將待檢測(cè)的細(xì)胞懸液與等體積的2×染液混合， 使其終濃度為: 5 μg/mL Hoechst33342， 2 μg/mL PI， 室溫下避光染色10min；PBS清洗兩次； 取100—200 μL樣品， 轉(zhuǎn)移到8孔腔室蓋玻片， 共聚焦顯微鏡下觀察并拍照， 按照染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率， 每個(gè)樣品重復(fù)3次計(jì)數(shù)， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3遍。

精子存活率檢測(cè)取適量待測(cè)細(xì)胞懸液并稀釋到合適濃度， 用蔡司倒置顯微鏡(Zeiss， Axio Observer Z1)觀察、拍攝精子活性并統(tǒng)計(jì)精子存活率。另外取少量細(xì)胞懸液， 用乙醇處理使精子死亡作為對(duì)照， 以消除拍攝精子活動(dòng)時(shí)， 因任何外界因素引起樣品震動(dòng)而導(dǎo)致的誤差。

細(xì)胞移植將組織塊凍存樣品所得細(xì)胞懸液用PKH26染色， 牛血清終止染色， PBS清洗兩遍備用。觀察分析受體斑馬魚的內(nèi)源PGCs和植入供體細(xì)胞的發(fā)育及分布。移植后斑馬魚仔魚在正常條件下飼養(yǎng)， 在細(xì)胞移植后3h、3d和5d， 通過熒光顯微鏡觀察植入細(xì)胞在受體內(nèi)的存活及整合情況。同時(shí)設(shè)未移植斑馬魚仔魚為空白對(duì)照組， 同樣條件飼養(yǎng)及觀察。用尼康熒光體視鏡(Nikon，SMZ1270)及奧林巴斯CCD(Olympus， DP73)進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 兩種凍存方法下的細(xì)胞存活率

Hoechst33342與PI共染， 正常細(xì)胞核能夠染上Hoechst33342而呈藍(lán)色。同時(shí)， 由于PI不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞中， 所以活細(xì)胞表現(xiàn)對(duì)PI拒染，而壞死細(xì)胞核可被PI染色[23]。因此， 活細(xì)胞染色結(jié)果為藍(lán)色+淺紅色或無(Hoechst33342+/PI–)， 死細(xì)胞為藍(lán)色+亮紅色(Hoechst33342+/PI+)。在樣品染色后， 在熒光顯微鏡下觀察， 按照核體積的大小及形態(tài)， 將細(xì)胞粗略分為精原干細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞及其他細(xì)胞三種規(guī)格(圖 1)。初步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)， 分離細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液中， 精原干細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞及其他細(xì)胞所占比例分別為11.57%、7.55%和80.88%； 而組織塊凍存復(fù)蘇后細(xì)胞中， 幾種細(xì)胞的含量為10.16%、9.65%和80.19%， 兩者的細(xì)胞構(gòu)成比例無明顯區(qū)別。熒光觀察拍照后統(tǒng)計(jì)各種細(xì)胞的存活率(表 1)。在本實(shí)驗(yàn)條件下， 分離細(xì)胞凍存方法所得的細(xì)胞中， 精原干細(xì)胞存活率為(34.94±4.36)%、精母細(xì)胞存活率為(39.41±4.94)%、精細(xì)胞及其他細(xì)胞的存活率為(41.00±8.93)%； 在組織塊凍存方法所得的細(xì)胞中， 精原干細(xì)胞存活率為(53.53±12.87)%、精母細(xì)胞存活率為(52.84±10.92)%、精細(xì)胞及其他細(xì)胞的存活率為(48.67±11.13)%。對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)， 結(jié)果顯示兩種凍存方法處理的精原干細(xì)胞存活率存在極顯著性差異(P＜0.01)， 精母細(xì)胞存活率存在顯著性差異(P＜0.05)， 而精細(xì)胞及其他細(xì)胞存活率在2種方法中無顯著性差異(表 1)。綜上所述， 組織塊法凍存復(fù)蘇獲得的精原干細(xì)胞和精母細(xì)胞的存活率均高于分離細(xì)胞凍存法， 尤其是精原干細(xì)胞的存活率， 組織塊法的顯著高于分離細(xì)胞的； 而對(duì)于精子細(xì)胞及其他細(xì)胞的存活率， 2種凍存方法的效果相近。因此， 在本實(shí)驗(yàn)條件下， 美洲鰣雄性生殖細(xì)胞在酶消化法分離細(xì)胞前， 將組織塊直接凍存的效果比細(xì)胞分離后凍存的好， 特別是組織塊法凍存復(fù)蘇的精原干細(xì)胞和精母細(xì)胞的存活率更高。

圖 1 美洲鰣雄性生殖細(xì)胞的核染色Fig. 1 The nuclear staining of male germ cells in American shad

2.2 兩種凍存方法下的精子存活率

鏡檢 2種凍存方法所得的細(xì)胞懸液中， 均有大量游動(dòng)的精子。在顯微鏡下因光線而呈現(xiàn)不同顏色； 而酒精處理后精子均死亡無游動(dòng)， 大量精子粘結(jié)成團(tuán)， 沉降到同一平面而顏色基本相同。在解凍復(fù)蘇后， 分離細(xì)胞凍存法所得精子存活率為(87.12±2.56)%， 組織塊凍存法所得精子存活率為(93.83±0.62)% (表 1)。對(duì)2種方法所得結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)， 結(jié)果顯示2種凍存方法處理的精子存活率存在極顯著性差異(P＜0.01)。因此， 在本實(shí)驗(yàn)條件下，美洲鰣精子在酶消化法分離細(xì)胞前， 將組織塊直接凍存的效果比細(xì)胞分離后凍存的好， 精子存活率更高。同時(shí)證明， 本實(shí)驗(yàn)條件下的凍存液及降溫方法可用于美洲鰣精子凍存。

2.3 組織塊凍存處理后細(xì)胞移植情況

將組織塊凍存處理后的細(xì)胞復(fù)蘇后用PKH26染色， 可使細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈紅色， 而黃色熒光標(biāo)記的斑馬魚受體內(nèi)源生殖細(xì)胞在綠色熒光下呈綠色信號(hào)， 可與供體細(xì)胞區(qū)分開來(圖 2)。移植3h后觀察， 供體細(xì)胞被注射到斑馬魚受體的生殖嵴附近， 共移植斑馬魚苗34條， 空白對(duì)照30條， 移植后觀察結(jié)果如表 2所示。移植后第3天觀察， 斑馬魚受體累計(jì)死亡數(shù)為19條(55.88%)， 存活的15條受體(44.12%)能在顯微鏡下觀察到供體細(xì)胞， 且定位在受體生殖嵴， 與受體內(nèi)源生殖細(xì)胞分布在同一區(qū)域；有個(gè)別受體中的供體細(xì)胞遷移到腹部或尾部， 證明所移植的細(xì)胞有一定遷移能力。而空白對(duì)照組存活數(shù)為24條(80.00%)。移植后第5天觀察， 斑馬魚受體累計(jì)死亡數(shù)為21條(61.76%)， 存活13條(38.24%)，此時(shí)3條受體能觀察到供體細(xì)胞和受體內(nèi)源生殖細(xì)胞定位于同一區(qū)域， 且有些供體細(xì)胞遷移到腹部或尾部； 4條受體能觀察到供體細(xì)胞分布在腹部和尾部， 而未分布在受體內(nèi)源生殖細(xì)胞的區(qū)域； 6條受體中未能觀察到供體細(xì)胞， 與空白對(duì)照組的觀察結(jié)果一致。而空白對(duì)照組存活數(shù)為23條(76.67%)， 此時(shí)發(fā)現(xiàn)斑馬魚有自發(fā)紅色熒光， 但仍能與供體細(xì)胞的紅色熒光區(qū)分開來。移植實(shí)驗(yàn)證明， 此實(shí)驗(yàn)條件下將美洲鰣成熟精巢剪碎后進(jìn)行組織塊直接凍存，解凍復(fù)蘇后所得雄性生殖細(xì)胞仍可以用于異種移植。

表 1 美洲鰣生殖細(xì)胞存活率Tab. 1 The germ cells viability of American shad

圖 2 美洲鰣雄性生殖細(xì)胞移植到斑馬魚仔魚Fig. 2 American shad male germ cells transplanted into zebrafish larvae

表 2 美洲鰣雄性生殖細(xì)胞移植情況Tab. 2 Transplantation of American shad male germ cells

3 討論

3.1 不同凍存方法對(duì)精巢細(xì)胞存活率的影響

生殖細(xì)胞在冷凍保存復(fù)蘇后的存活率受多種因素影響， 包括樣品處理、凍存液的選擇、凍存溫度、凍存時(shí)間、降溫及復(fù)蘇速率等。常見的細(xì)胞凍存方法都是將分離或培養(yǎng)的游離細(xì)胞進(jìn)行凍存及復(fù)蘇， 再用于其他實(shí)驗(yàn)研究。而在本研究中， 除了將分離細(xì)胞進(jìn)行凍存， 還進(jìn)行了精巢組織塊的直接冷凍保存， 以探索有效保存美洲鰣精巢細(xì)胞的方法。更重要的是， 本研究中采用的凍存方法能同時(shí)保存各期生殖細(xì)胞， 優(yōu)于只能進(jìn)行單一細(xì)胞保存的傳統(tǒng)方法， 即精子保存[24]或精原干細(xì)胞保存[25]。在此， 比較分析了2種方法的凍存效果， 結(jié)果表明組織塊凍存法， 凍存復(fù)蘇獲得的精原干細(xì)胞和精母細(xì)胞的存活率更高， 而精細(xì)胞及其他細(xì)胞存活率無顯著性差異。與此類似， 其他研究組報(bào)道的西伯利亞鱘性腺組織和性腺細(xì)胞2種凍存方法的比較研究， 表明組織凍存復(fù)蘇后分離獲得的細(xì)胞中， 包含的死細(xì)胞較少[8]。在斑馬魚PGCs凍存研究中， Higaki等[3]比較了不同預(yù)處理液和玻璃化凍存保護(hù)劑的冷凍效果， 最適冷凍條件下斑馬魚PGCs的存活率可達(dá)81%， 而且復(fù)蘇后的PGCs仍能進(jìn)一步分化而產(chǎn)生功能性配子， 證明了凍存的生殖細(xì)胞可用于細(xì)胞移植研究。另外， 在細(xì)胞生物學(xué)研究中， 一般采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測(cè)分析[7]。但有研究發(fā)現(xiàn)臺(tái)盼藍(lán)染色法不適合于某些細(xì)胞的活力測(cè)定， 如朱冬發(fā)等[26]在檢測(cè)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)精子的活力時(shí)采用臺(tái)盼藍(lán)染色無法清晰辨別死、活精子； Stoll等[27]測(cè)定人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonal endothelial cell， HPMEC)在凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞存活率， 認(rèn)為臺(tái)盼藍(lán)染色會(huì)使結(jié)果偏高。而有研究表明Hoechst33342/PI雙染可簡(jiǎn)單快捷地區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞， 且特異性高， 簡(jiǎn)單易行[23]。因此， 本研究采用Hoechst33342與PI共染細(xì)胞核的方法來檢測(cè)生殖細(xì)胞存活率。美洲鰣細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342和PI染色后， 各期生殖細(xì)胞核均清晰可見， 大小分明， 且Hoechst33342使全部細(xì)胞染色而PI能明顯將死活細(xì)胞區(qū)分開來(圖1)， 證明細(xì)胞核Hoechst33342/PI雙染法適合于進(jìn)行凍存復(fù)蘇的美洲鰣生殖細(xì)胞存活率的檢測(cè)。

3.2 不同凍存方法對(duì)精子存活率的影響

精子凍存也是常見的種質(zhì)資源保存方法， 此前已有研究者進(jìn)行了美洲鰣精子凍存的研究分析。例如， 王明華等[24]用魚用任氏液和甲醇配成凍存液，精液稀釋后采用三步法降溫并于液氮中凍存， 60d后復(fù)蘇發(fā)現(xiàn)精子存活率達(dá)80%， 同時(shí)凍存液的甲醇比例、冷凍前平衡時(shí)間及精液稀釋比均對(duì)保存效果有不同程度的影響。與傳統(tǒng)的精液凍存方法不同的是， 本研究通過直接凍存成魚精巢組織以進(jìn)行精子的冷凍保存， 凍存步驟簡(jiǎn)單易行， 重要的是本凍存方法所得精子存活率達(dá)93.83%， 且樣品凍存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)～250d， 凍存精子的存活率仍遠(yuǎn)高于已有的報(bào)道結(jié)果[24]。此結(jié)果的獲得， 可能是因?yàn)闃悠诽幚矸椒?、凍存液成分和降溫程序等?yōu)化所致， 但具體原因仍需進(jìn)一步研究分析來驗(yàn)證。研究所用DMSO為常見的凍存保護(hù)劑， 在黃姑魚[11]、大黃魚[12]和黑鯛(Sparus macrocephalus)[28]的精子凍存實(shí)驗(yàn)中， 均發(fā)現(xiàn)DMSO濃度為10%時(shí)凍存精子的質(zhì)量最好， 其中黃姑魚精子激活率達(dá)85.25%， 黑鯛凍精激活率達(dá)92.91%， 特別是10% DMSO的條件下， 大黃魚凍精復(fù)蘇后其活力、DNA損傷和線粒體及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)保持完整性的精子比例， 與鮮精相比無明顯差異。因此， 本研究中凍存液DMSO濃度為10%， 但進(jìn)行美洲鰣生殖細(xì)胞凍存的最佳濃度還需另行驗(yàn)證。

3.3 冷凍保存精巢細(xì)胞的應(yīng)用潛能

凍存復(fù)蘇的細(xì)胞可進(jìn)一步用于細(xì)胞培養(yǎng)、基因編輯及細(xì)胞移植等研究中， 因此， 有效的細(xì)胞凍存方法是物種資源保存研究中的重要技術(shù)。在魚類中， 已有研究報(bào)道， 將凍存復(fù)蘇的早期生殖細(xì)胞成功移植到異種不育受體中， 使受體產(chǎn)生供體細(xì)胞來源的功能性配子[8]。在研究中， 發(fā)現(xiàn)組織塊凍存法， 獲得的精原干細(xì)胞存活率更高， 更適合于進(jìn)行生殖細(xì)胞的種間移植。細(xì)胞植入受體5d后仍能在斑馬魚受體內(nèi)檢測(cè)到供體細(xì)胞， 證明凍存復(fù)蘇的細(xì)胞依舊具有增殖及發(fā)育活性， 而且具有一定的遷移整合到受體性原基的能力。與此類似， Lee等[6]將虹鱒精巢組織進(jìn)行了凍存， 解凍后將A型精原干細(xì)胞移植到同種三倍體魚中也能獲得供體來源的配子。

綜上所述， 本文進(jìn)行了美洲鰣精巢細(xì)胞的冷凍保存、復(fù)蘇、活性檢測(cè)等技術(shù)的研究， 發(fā)現(xiàn)組織塊凍存方法所得到的細(xì)胞存活率更高， 尤其是早期生殖細(xì)胞的成活率比較高， 更適合于進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞移植研究。此外， 組織塊凍存法由于樣品前期處理簡(jiǎn)便， 更適合于野外資源的采集與保護(hù)。但美洲鰣生殖細(xì)胞的最適凍存條件及移植效果等需要更進(jìn)一步的長(zhǎng)期觀察及研究才能確定。本研究結(jié)果為將來開展水產(chǎn)動(dòng)物生殖細(xì)胞工程育種及物種種質(zhì)資源保護(hù)等研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1] Xu H Y， Li M Y， Gui J F，et al. Fish germ cells [J].Science China Life Sciences， 2010， 53(4): 435—446

[2] Yi M S， Hong N， Li Z D，et al. Medaka fish stem cells and their applications [J].Science China Life Sciences，2010， 53(4): 426—434

[3] Higaki S， Kawakami Y， Eto Y，et al. Cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) primordial germ cells by vitrefication of yolk-intact and yolk-depleted embryos using various cryoprotectant solutions [J].Cryobiology， 2013，67(3): 374—382

[4] Tonus C， Connan D， Waroux O，et al. Cryopreservation of chicken primordial germ cells by vitrification and slow-freezing: a comparative study [J].Theriogenology，2017， 88: 197—206

[5] Fujiwara K， Kamoshita M， Kato T，et al. Generation of rats from vitrified oocytes with surrounding cumulus cells via in vitro fertilization with cryopreserved sperm [J].Animal Science Journal， 2017， 88(1): 180—184

[6] Lee S， Iwasaki Y， Shikina S，et al. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes[J].PNAS， 2013， 110(5): 1640—1645

[7] Lee S， Katayama N， Yoshizaki G. Generation of juvenile rainbow trout derived from cryopreserved whole ovaries by intraperitoneal transplantation of ovarian germ cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2016， 478(3): 1478—1483

[8] P?eni?ka M， Saito T， Rodina M，et al. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeonAcipenser baeriigerm cells， comparison of whole tissue and dissociated cells [J].Cryobiology， 2016， 72(2): 119—122

[9] Lee S， Yoshizaki G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout(Brachymystax lenok) [J].Cryobiology， 2016， 72(2):165—168

[10] Shi Y X， Cheng S， Zhu J Q，et al. Sperm cryopreservation and enzyme activity detection inLateolabrax maculatus[J].Acta Hydrobiologica Sinica， 2015， 39(6):1241—1247 [史應(yīng)學(xué)， 程順， 竺俊全， 等. 中國(guó)花鱸精子的超低溫冷凍保存及酶活性檢測(cè). 水生生物學(xué)報(bào)， 2015，39(6): 1241—1247]

[11] Jin C H， Yan J Q， Zhu J Q，et al. Sperm cryopreservation and the cytoarchitecture damage detection inNibea albiflora[J].Journal of Fisheries of China， 2011， 35(6):846—853 [金春華， 閆家強(qiáng)， 竺俊全， 等. 黃姑魚精子的超低溫凍存及細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的檢測(cè). 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2011，35(6): 846—853]

[12] Jiang J H， Yan J Q， Zhu J Q，et al. Sperm cryopreservation and the cytoarchitecture damage detection ofPseudosciaena crocea[J].Journal of Agricultural Biotechnology， 2011， 19(4): 725—733 [姜建湖， 閆家強(qiáng)， 竺俊全， 等. 大黃魚精子的超低溫凍存及細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的檢測(cè). 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2011， 19(4): 725—733]

[13] Xie X， Li P， Xi M D，et al. Digestion， isolation and cryopreservation of testicular cells from Dabry sturgeon(Acipenser dabryanus) [J].Freshwater Fisheries， 2016，46(5): 19—24 [頡璇， 厲萍， 席萌丹， 等. 達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞消化分離和超低溫冷凍保存. 淡水漁業(yè)， 2016， 46(5):19—24]

[14] Zhu X， Chi Y， Wang H，et al. Comparison of cryopreserved effect between epithelioma papulosum cyprinid ofCyprinus carpioand grass carp ovary cell lines [J].Chinese Journal of Biologicals， 2010， 23(4): 381 [朱霞，遲源， 王好， 等. 鯉魚上皮瘤細(xì)胞和草魚性腺細(xì)胞凍存效果的比較. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2010， 23(4): 381]

[15] Elzey S P， Rogers K A， Trull K J. Comparison of 4 aging structures in the American shad (Alosa sapidissima) [J].Fishery Bulletin- National Oceanic and Atmospheric Administration， 2015， 113(1): 47—54

[16] Tang G P， Huang A Q， Wei Q W. The resource fluctuations and restoration of American shad (Alosa sapidissima) [J].Journal of Hydroecology， 2010， 3(1):130—134 [唐國(guó)盤， 黃安群， 危起偉. 美洲鰣的資源變動(dòng)及修復(fù). 水生態(tài)學(xué)雜志， 2010， 3(1): 130—134]

[17] Gao X Q， Liu Z F， Guan C T，et al. Developmental changes in digestive enzyme activity in American shad，Alosa sapidissima， during early ontogeny [J].Fish Physiology & Biochemistry， 2017， 43(2): 397—409

[18] Du H， Wei Q W. Biology characteristics and resources status of America shad [J].Freshwater Fisheries， 2004，34(1): 62—64 [杜浩， 危起偉. 美洲鰣的生物學(xué)特征及資源狀況. 淡水漁業(yè)， 2004， 34(1): 62—64]

[19] Hong X Y， Zhu X P， Chen K C，et al. Study on the development of the embryo and larva of American shad，Alosa sapidissima[J].Acta Hydrobiologica Sinica， 2011， 35(1):153—162 [洪孝友， 朱新平， 陳昆慈， 等. 美洲鰣胚胎及仔稚魚的發(fā)育. 水生生物學(xué)報(bào)， 2011， 35(1): 153—162]

[20] Xu G C， Zhang C X， Zheng J L，et al. Artificial propagation and embryonic development of American shad，Alosa sapidissima[J].Marine Sciences， 2012， 36(7): 89—96[徐鋼春， 張呈祥， 鄭金良，等. 美洲鰣的人工繁殖及胚胎發(fā)育的研究. 海洋科學(xué)， 2012， 36(7): 89—96]

[21] Hong X Y， Chen K C， Li K B，et al. Experiment of cage culture in reservoir of American shad，Alosa sapidissima[J].Journal of Aquaculture， 2014， 35(2): 8—9 [洪孝友，陳昆慈， 李凱彬， 等. 水庫(kù)網(wǎng)箱美洲鰣養(yǎng)殖試驗(yàn). 水產(chǎn)養(yǎng)殖， 2014， 35(2): 8—9]

[22] Zhang Y， Xu G C， Du F K，et al. Effects of acute handling stress on serum biochemical parameters andHSP70 gene expression inAlosa sapidissima broodstocks[J].Journal of Shanghai Ocean University， 2016， 25(5):652—658 [張勇， 徐鋼春， 杜富寬， 等. 急性操作脅迫對(duì)美洲鰣親魚血清生化指標(biāo)及HSP70基因表達(dá)的影響. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 25(5): 652—658]

[23] Yang X F， He C E， Tang R H，et al. A comparative study on the measurement of neuronal cell apoptosis by Hoechst33342/PI double staining and TUNEL assay [J].Carcinogenesis Teratogenesis & Mutagenesis， 2014，26(3): 180—184 [楊細(xì)飛， 賀春娥， 湯瑞華， 等.Hoechst33342/PI雙染法和TUNEL染色技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的對(duì)比研究. 癌變 畸變 突變， 2014， 26(3):180—184]

[24] Wang M H， Chen Y M， Ding S Y，et al. Studies on sperm cryopreservation technology of American shad，Alosa sapidissima[J].Jiangsu Agricultural Sciences， 2015，43(7): 250—251 [王明華， 陳友明， 丁淑燕， 等. 美洲鰣魚精子超低溫冷凍保存技術(shù)初探. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015，43(7): 250—251]

[25] Linhartová Z， Rodina M， Guralp H，et al. Isolation and cryopreservation of early stages of germ cells of tench(Tinca tinca) [J].Czech Journal of Animal Science， 2014，59(8): 381—390

[26] Zhu D F， Zhou S. Viability assessment of spermatozoa in the swimming crabPortunus trituberculatus[J].Journal of Fisheries of China， 2008， 32(5): 765—771 [朱冬發(fā)， 周帥. 三疣梭子蟹精子活力的評(píng)價(jià)方法. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2008，32(5): 765—771]

[27] Stoll C， Hofmann N， Bernemann I，et al. Systematic optimisation of parameters for cryopreservation of human pulmonal endothelial cells (HPMEC): Difference in cell survival rates analyzed by recultivation vs. trypanblue staining [J].Cryobiology， 2008， 57(3): 337—338

[28] Ye T， Zhu J Q， Yang W X，et al. Sperm cryopreservation inSparus macrocephalusand DNA damage detection with SCGE [J].Zoological Research， 2009， 30(2):151—157 [葉霆， 竺俊全， 楊萬喜， 等. 黑鯛精子的超低溫凍存及DNA損傷的SCGE檢測(cè). 動(dòng)物學(xué)研究， 2009，30(2): 151—157]