鎘對大型溞攝食能力和相關(guān)生理指標的影響

王 茜 郭鵠飛 王 蘭

(山西大學生命科學學院， 太原 030006)

鎘作為一種強致癌物質(zhì)， 對水生生物的影響越來越受到人們的高度重視[1]。研究發(fā)現(xiàn)， 鎘的半衰期長， 能夠在動物體內(nèi)蓄積并產(chǎn)生毒性， 對機體造成氧化損傷， 產(chǎn)生大量的自由基， 同時也增加細胞膜的通透性， 為其他重金屬進入細胞提供便利[2，3]。鎘會影響水生動物的攝食能力， 造成攝食率的降低或停止。例如， 側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa)在較低濃度的重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+)脅迫下， 周期性活動或攝食的行為都產(chǎn)生異常， 在較高的濃度下使得珊瑚無法適應(yīng)并導(dǎo)致死亡[4]； 水螅(Hydra peseudoligactis)攝食率在受到重金屬離子(Cu2+、Cr6+、Zn2+、Cd2+、Pb2+)脅迫時也會受到抑制[5，6]； 安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomus Annandalei)在急性以及慢性重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+)中毒后， 攝食率會受到一定程度影響， 且雄性成體的攝食率普遍低于雌性成體的[7]。水生動物的攝食能力受到抑制將導(dǎo)致其營養(yǎng)物攝取量的減少，并對其生長和繁殖產(chǎn)生干擾。因此， 攝食能力是獲得一切生命活動所必需的物質(zhì)和能量的基礎(chǔ)。同時， 也是水生動物毒性應(yīng)激反應(yīng)在生態(tài)上重要而敏感的指標。

在水生生態(tài)環(huán)境中， 大型溞(Daphnia magna)作為國際公認的標準試驗生物， 已被廣泛用于生態(tài)毒理學和水生生態(tài)學的研究[8]。大型溞在淡水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中占優(yōu)越性地位， 且生殖周期短、繁殖迅速、對水體中有害污染物質(zhì)敏感等特點也使其在水環(huán)境質(zhì)量評價中得到普遍應(yīng)用[9，10]。

鑒于此， 本實驗研究了鎘脅迫下大型溞的攝食率、濾水率、鎘的蓄積量、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性。初步探討了鎘對大型溞攝食能力的影響及機制， 旨在為溞類攝食的深入研究、為水質(zhì)監(jiān)測提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗中所用到的大型溞已經(jīng)在標準條件下培養(yǎng)了2年以上， 其敏感度達到中華人民共和國國家標準《水質(zhì)、物質(zhì)對溞類(大型溞)急性毒性測定方法》(GB/T13266-91)[11]的要求， 培養(yǎng)大型溞的水溫(20±1)℃、pH 7.2、溶氧量7 mg/L、光照周期光∶暗=16h∶8h； 普通小球藻(Chlorella vulgaris)藻種購自中國科學院淡水藻種庫。

1.2 主要試劑

氯化鎘(CdCl2.2.5H2O， 分析純)購自天津市博迪化工有限公司， 實驗前用雙蒸水配成1000 mg/L母液； 標準鎘溶液(1000 mg/L)由環(huán)境保護部標準樣品研究所提供； 硝酸(優(yōu)級純， 北京化工廠)； 30%過氧化氫(分析純， 天津市天力化學試劑有限公司)； 乙酰膽堿酯酶(AChE)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所； 蛋白含量測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實驗方法

實驗設(shè)計依據(jù)國家地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB3838-2002)[12]， Ⅴ類水質(zhì)的鎘濃度標準限值的1倍、5倍、9倍， 設(shè)置了3個鎘濃度組(0.01、0.05和0.09 mg/L)、1個空白對照和2個處理時間(24h和48h)。除攝食率和濾水率的測定實驗中大型溞喂食外， 其他實驗處理期間不喂食。

攝食率與濾水率的測定在實驗前選取大小一致、含卵的大型溞100只放入2 L的燒杯中培養(yǎng)， 18h后取走母溞， 24h時選擇個體大小基本一致的120只一日齡幼溞(＜24h)， 每個實驗組添加相同數(shù)量的小球藻和10只幼溞， 同時設(shè)置實驗對照組(加入相同數(shù)量的小球藻但不加幼溞)。小球藻的初始密度為5×105cells/mL， 在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 溫度(20±1)℃。參照光密度法測定鎘染毒24h、48h后小球藻的密度。依據(jù)相應(yīng)公式計算濾水率(F)和攝食率(I)[13]。

大型溞體內(nèi)鎘含量的測定參照火焰原子吸收法[14]測定大型溞體內(nèi)的鎘含量。

T-AOC、MDA含量和AChE活性的測定分別在染毒24h、48h取樣。按生物量0.1 g/400 μL加入預(yù)冷的生理鹽水， 在冰浴條件下用電動勻漿器制備勻漿液， 4℃、12000 r/min離心30min， 取上清液作為酶源。按照試劑盒提供的步驟對T-AOC、MDA含量、AChE活性和蛋白濃度進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)， 數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標準差(Mean±SD)表示， *P＜0.05表示顯著性差異，**P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 鎘對大型溞攝食率與濾水率的影響

如圖 1所示， 大型溞的攝食率(圖 1A)和濾水率(圖 1B)隨著鎘濃度的升高均呈現(xiàn)下降趨勢。鎘處理24h， 濃度為0.09 mg/L時， 大型溞濾水率和攝食率與對照組相比顯著降低(P＜0.05)； 而濃度為0.01 mg/L、0.05 mg/L時， 濾水率和攝食率無顯著性差異。鎘處理48h， 與對照組相比， 各濃度組濾水率均極顯著降低(P＜0.01)； 攝食率也呈現(xiàn)顯著性或極顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)， 且鎘濃度為0.09 mg/L時，攝食率比對照組降低了43.89%。

圖 1 鎘對大型溞攝食率(A)和濾水率(B)的影響Fig. 1 Effect of cadmium on the ingestion rate (A) and filtration rate (B) in Daphnia magna

2.2 鎘在大型溞體內(nèi)的積累

由圖 2可知， 鎘在大型溞體內(nèi)的蓄積量隨著濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢。與對照組相比， 鎘處理24h、48h， 濃度0.05 mg/L時的蓄積量顯著高于對照組(P＜0.05)； 濃度0.09 mg/L時的蓄積量極顯著高于對照組(P＜0.01)； 濃度0.01 mg/L時沒有顯著性。通過相關(guān)性分析， 鎘的蓄積量與濃度之間存在較高的相關(guān)性(R2=0.9903)(圖 3)。

圖 2 鎘在大型溞體內(nèi)的積累Fig. 2 Bioaccumulation of cadmium in Daphnia magna

圖 3 鎘在大型溞體內(nèi)的積累量與鎘濃度的相關(guān)性Fig. 3 The correlation between the accumulation of cadmium inDaphnia magna and its concentrations

2.3 鎘對大型溞總抗氧化能力(T-AOC)和脂質(zhì)過氧化(MDA)的影響

由圖 4可見， 大型溞T-AOC隨鎘濃度的升高而增加， 具有濃度—效應(yīng)關(guān)系。鎘處理24h、48h， 濃度0.09 mg/L時， T-AOC與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。而且在鎘處理后， T-AOC與攝食率之間呈負相關(guān)性， 相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9521、0.9389 (表1)。

由圖 5可知， 大型溞體內(nèi)MDA含量隨鎘濃度的升高表現(xiàn)出上升趨勢。處理24h， 濃度0.05 mg/L時，MDA含量較對照組有極顯著差異(P＜0.01)。處理24h、48h， 濃度0.09 mg/L時， 與對照組相比MDA含量有顯著差異(P＜0.05)。

2.4 鎘對大型溞乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響

由圖 6可看出， 大型溞體內(nèi)AChE活性隨著鎘濃度的升高而降低。與對照組相比， 鎘處理24h、48h，濃度0.01 mg/L時， 酶活力與對照組無顯著性差異(P＞0.05)； 濃度0.05 mg/L、0.09 mg/L時， 酶活力顯著低于對照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 鎘的積累對大型溞攝食能力的影響

鎘在大型溞體內(nèi)的積累量具有濃度—時間效應(yīng)， 尤其在濃度0.09 mg/L時， 大型溞體內(nèi)的蓄積量極顯著高于對照組(P＜0.01)。水體中的鎘以帶正電的Cd2+形式存在， 可經(jīng)過體表直接進入大型溞體內(nèi)[15]；另外， 也可吸附于小球藻通過攝食進入機體[16]。通過以上2種途徑進入機體的鎘一部分會被自身代謝，但大部分蓄積在體內(nèi)， 從而對大型溞正常的生理功能產(chǎn)生影響。此外， 大型溞食用未被污染的藻類，腸道需要15—30min可以完全凈化， 而食用被鎘污染后的藻類后， 需要3—6h才能完全凈化干凈[17]， 表明鎘污染后造成了大型溞腸道蠕動能力降低， 延長食物在腸道的停留時間。

圖 4 鎘對大型溞總抗氧化能力(T-AOC)的影響Fig. 4 Effect of cadmium on total antioxidant capacity (T-AOC)of Daphnia magna

表 1 鎘脅迫下大型溞不同測定參數(shù)與攝食率的相關(guān)性分析Tab. 1 The correlation of feeding rate and different assays performed with D. magna for cadmium

圖 5 鎘對大型溞丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 5 Effect of cadmium on malondialdehyde (MDA) content in Daphnia magna

圖 6 鎘對大型溞乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響Fig. 6 Effect of cadmium on the activities of acetylcholine esterase (AChE) in Daphnia magna

大型溞通過攝食來獲得生命活動所必需的物質(zhì)和能量， 從而保證其個體的生長、發(fā)育和種群的延續(xù)。當大型溞受到鎘脅迫時， 攝食率可以很好的反映其攝食能力及能量物質(zhì)的變化情況[18]。文獻報道， 在大型溞攝取藍藻后， 腸道內(nèi)食物的充盈度相對于對照組來說不到58%， 腸道中葉綠素a含量是對照組的1/3， 表明大型溞的攝食行為受到抑制[19]。在本實驗中， 在大型溞受到鎘脅迫后較短的時間內(nèi)， 低濃度鎘對大型溞的攝食率與對照組相比無顯著性差異。可能是短時間內(nèi)， 較低濃度鎘所造成的毒害能夠被機體自身的抗氧化系統(tǒng)修復(fù)， 不會對機體產(chǎn)生傷害[20]。當較高濃度鎘處理后， 大型溞的攝食能力受到抑制， 且攝食率與鎘蓄積量存在相關(guān)性(R2=0.9354)(表 1)。此外， 小球藻作為食物對大型溞來說比較適口， 實驗過程的環(huán)境條件(溫度和光照)也都適宜其生長， 排除這些外在因素的干擾， 認為大型溞攝食情況變化是由于鎘脅迫導(dǎo)致的。

3.2 鎘對大型溞T-AOC、MDA與AChE的影響

T-AOC是衡量機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能整體狀況的綜合性指標。當機體處于鎘脅迫時， 過多的自由基使機體內(nèi)許多重要的生物大分子發(fā)生不可逆的氧化損傷， 導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。而MDA作為脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物， 可以反映在鎘脅迫下氧化應(yīng)激的嚴重程度[21—23]。鎘誘導(dǎo)的抗氧化能力升高可促進ROS的清除過程； 反之， ROS的過度產(chǎn)生可以提高細胞或生物體中的MDA水平。在本實驗中， 暴露于高濃度鎘溶液的大型溞T-AOC和MDA含量高于對照組。MDA含量的升高表明鎘的毒性對大型溞體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)造成了一定程度的損傷。而TAOC的升高是因為在大型溞受到鎘脅迫后， 抗氧化酶系統(tǒng)在脅迫輕微時會被激活， 來維持機體自由基的代謝平衡。因此， T-AOC的提高為代償性增高，用以清除鎘脅迫后機體產(chǎn)生的過多的活性氧自由基。當氧自由基水平高于機體抗氧化能力時， 將誘發(fā)氧化應(yīng)激， 并導(dǎo)致氧化損傷。脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化會對生物體組織器官造成不同程度的危害， 其中對消化道的損傷在動物中發(fā)生率最高[24]，而營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收依賴于腸道蠕動及吸收細胞的完整性和消化酶活性發(fā)揮正常的生理功能。此外， 有研究報道， 攝食率的變化與氧化應(yīng)激的相關(guān)性很高[25，26]， 這與本實驗中鎘脅迫后大型溞體內(nèi)T-AOC與攝食率之間的相關(guān)系數(shù)達0.9521或0.9389的結(jié)果是相一致的(表 1)。所以鎘脅迫后造成機體的氧化損傷， 從而干擾了大型溞對食物的消化與吸收。

乙酰膽堿酯酶是神經(jīng)傳導(dǎo)抑制劑的特異性生物標志物， 參與乙酰膽堿的降解， 使神經(jīng)信號分子可以在生物體內(nèi)正常傳遞[27]。當水環(huán)境中的毒物濃度較高時， 大型溞的神經(jīng)系統(tǒng)會遭到破壞， 所以檢測AChE活性變化可以用來反映水體污染的情況[28]。攝食行為是維持機體代謝處理穩(wěn)恒狀態(tài)的一種調(diào)節(jié)性行為， 大型溞在攝食時， 第1、第2對胸肢的運動帶動水流和食物隨進入殼瓣， 第3、第4對胸肢上的濾器將食物濾取并凝聚成食物團后被胸肢向上推動最終進入口中， 而后腹部及基部的尾爪不斷運動將殼瓣內(nèi)殘留物清理出殼瓣[29]。在本實驗中， 在較高濃度的鎘(0.05 mg/L、0.09 mg/L)脅迫下大型溞體內(nèi)AChE活性降低， 可能是Cd2+以靜電吸引的形式與AChE活性中心的陰離子相結(jié)合， 造成乙酰膽堿的季銨陽離子基團與酶的活性中心結(jié)合的能力降低， 引起組織內(nèi)AChE活性下降， 干擾了大型溞神經(jīng)傳遞的正常功能。大型溞主要依靠其神經(jīng)系統(tǒng)協(xié)調(diào)下的附肢劃動完成攝食[30]， 毒物可以通過損害大型溞的神經(jīng)系統(tǒng)限制游泳行為和附肢運動來影響其濾水能力[31，32]， 最終導(dǎo)致攝食率的降低[33，34]。這與本實驗中大型溞暴露于鎘環(huán)境較長時間后攝食率與濾水率降低是一致的。

4 結(jié)論

鎘對大型溞的攝食能力具有抑制作用， 表現(xiàn)在攝食率和濾水率隨鎘處理濃度的升高而顯著下降。大型溞受到鎘脅迫后， 攝食能力降低的機制與體內(nèi)AChE活性的下降， T-AOC水平的升高及MDA含量的上升有關(guān)。

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