大鯢短型肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-S的克隆及其功能研究

任詩思 齊志濤 昌鳴先

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所， 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072；2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049； 3. 鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院， 鹽城 224051)

肽聚糖識(shí)別蛋白(Peptidoglycan recognition protein， PGRPs)是一類廣泛存在于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中， 能特異地識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖(Peptidoglycan， PGN)成分的高度保守的模式識(shí)別受體。PGRP最早是在家蠶的血淋巴和角質(zhì)層中被發(fā)現(xiàn)[1]。之后， 隨著黑腹果蠅(Drosophila elanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)及人類基因組測(cè)序的發(fā)展， 相繼在哺乳動(dòng)物和昆蟲中發(fā)現(xiàn)了PGRPs家族的眾多成員[2—4]。此后， 在其他的無脊椎動(dòng)物(如軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物)和脊椎動(dòng)物(魚類、兩棲類、鳥類)中也相繼有PGRPs基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定[5—9]。

昆蟲PGRPs家族成員根據(jù)其mRNA轉(zhuǎn)錄本的大小分為短型PGRP (PGRP-S)和長(zhǎng)型PGRP (PGRPL)。哺乳動(dòng)物的4個(gè)PGRPs成員， 最初按照mRNA轉(zhuǎn)錄本的大小命名為短型PGRP (PGRP-S)、中型PGRP (PGRP-I， 包括PGRP-Iα/PGRP-Iβ)和長(zhǎng)型PGRP (PGRP-L)[4]， 后更名為PGLYRP-1、PGLYRP-2、PGLYRP-3、PGLYRP-4。短型PGRP(PGRP-S)， 大約含有200個(gè)氨基酸殘基， 蛋白分子量19—20 kD左右， 其含有的PGRP結(jié)構(gòu)域占據(jù)其絕大部分序列。有的中型PGRP (如哺乳動(dòng)物PGLYRP-3、PGLYRP-4)或長(zhǎng)型的PGRP (如果蠅PGRPLF)則含有2個(gè)PGRP結(jié)構(gòu)域。此外， 長(zhǎng)型PGRP除了C端的PGRP結(jié)構(gòu)域外， 還包含一段長(zhǎng)度可變的N端序列； 且該N端序列在PGRPs家族成員中不保守， 賦予每個(gè)PGRP獨(dú)特性和功能多樣性。PGRPs家族成員大多數(shù)為分泌蛋白(如果蠅PGRP-SA和PGRPSD、哺乳動(dòng)物PGLYRP1等)， 少部分是跨膜蛋白(如果蠅PGRP-LF)和胞內(nèi)蛋白(如果蠅PGRP-LE)。

在天然免疫系統(tǒng)中， PGRPs主要作為模式識(shí)別受體、調(diào)節(jié)子和效應(yīng)分子發(fā)揮作用。在不同的物種中PGRPs的功能具有一定的保守性， 但也存在著明顯的差異。昆蟲PGRPs功能主要包括激活酚氧化酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)、激活Toll信號(hào)通路、激活I(lǐng)MD信號(hào)通路以及具有酰胺酶活性[5]。哺乳動(dòng)物PGRPs的功能主要包括具有酰胺酶活性和直接的殺菌活性2個(gè)方面[10]。魚類作為低等脊椎動(dòng)物， 進(jìn)化上處于昆蟲和哺乳動(dòng)物之間， 它們的PGRPs卻同時(shí)兼具酰胺酶活性和直接的殺菌活性[8]。兩棲動(dòng)物在進(jìn)化上介于魚類和哺乳動(dòng)物之間， 目前關(guān)于兩棲類的PGRPs報(bào)道甚少。而大鯢(Andrias davidianus， 俗稱“娃娃魚”)， 作為現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動(dòng)物， 存在已有三億五千多萬年的歷史， 有“活化石”之稱， 具有極高的學(xué)術(shù)科研價(jià)值、醫(yī)用和食用等經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來， 由于自然環(huán)境的破壞， 非法捕殺、走私販賣等原因， 野生大鯢資源量急劇下降； 而人工養(yǎng)殖大鯢隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大， 大鯢的各種病害也接踵而來， 其細(xì)菌性以及病毒性疾病成為大鯢產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制瓶頸。

我們以往的研究揭示了硬骨魚類短型的PGRPSC或者PGRP5、長(zhǎng)型的PGRP6的選擇性剪接及其免疫功能[11—14]。本研究構(gòu)建了兩棲動(dòng)物大鯢短型肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-S的真核表達(dá)質(zhì)粒， 并研究了其抗菌活性、PGN結(jié)合活性、酰胺酶活性以及對(duì)NF-κB啟動(dòng)子活性的影響。該研究為揭示脊椎動(dòng)物PGRPs在進(jìn)化中的功能異同以及大鯢的免疫防治奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、細(xì)菌菌株及主要試劑

HEK293T (Human embryonic kidney cell)和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tardaPPD130/91)由本實(shí)驗(yàn)室保存并培養(yǎng)。Lys-type PGN (No.77140)或Dap-type PGN (No. 69554)購買于Sigma公司。

1.2 真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

大鯢PGRP-S的真核表達(dá)質(zhì)粒由鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院的齊志濤博士克隆并提供。真核表達(dá)的上游引物為CCCAAGCTTATGGGTGA GTGCTTGTTAC； 下游引物為CGGGATCCGGGCA GCAGAGTCGGCGTTTTTTCTGTG， 下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

1.3 生物信息學(xué)分析

大鯢PGRP-S的結(jié)構(gòu)域通過NCBI網(wǎng)站CD-search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)； 使用SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽； 多序列比對(duì)使用ClustalW1.83分析； 不同物種同源基因的相似性用MatGat2.02分析[15]； 大鯢PGRP-S和其他脊椎動(dòng)物PGRPs的進(jìn)化關(guān)系采用MEGA4.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining， NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹來分析，設(shè)置1000次bootstraps進(jìn)行評(píng)估。

1.4 NF-κB活性分析

將HEK293T細(xì)胞接種24孔板(3×105/孔)， 37℃5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將200ng的pNF-κB-Luc報(bào)告質(zhì)粒和1 ng Rellina內(nèi)參質(zhì)粒分別與不同量的p3xFLAG或PGRP-S-FLAG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。48h后收集并裂解細(xì)胞， 用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測(cè)樣品的熒光素酶活性。

1.5 抗菌活性分析

胞內(nèi)抗菌活性分析 將HEK293T細(xì)胞接種24孔板并培養(yǎng)過夜， 分別將p3xFLAG或PGRP-SFLAG轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(0.5 μg/孔)。隨后用遲緩愛德華氏菌(MOI=10)感染過表達(dá)的細(xì)胞(170×g， 離心5min； 25℃， 感染1h)， 用1×PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，加入100 μg/mL慶大霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基殺胞外菌1h， 隨后再更換為16 μg/mL慶大霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。分別在感染3h和6h后用1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3—5次， 再用含1%Triton-X100的PBS緩沖液裂解細(xì)胞并將細(xì)胞裂解產(chǎn)物梯度稀釋后涂布平板， 計(jì)數(shù)。

胞外抗菌活性分析 細(xì)胞種板及感染步驟同上， 不加入含有慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基。感染3h和6h后， 分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清梯度稀釋后涂布平板， 計(jì)數(shù)。

1.6 肽聚糖結(jié)合活性分析

將HEK293T細(xì)胞接種6孔板(1×106/孔)并培養(yǎng)過夜， 分別將pTurbo-GFP、p3xFLAG或PGRP-SFLAG轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(2.5 μg/孔)， 36—48h后提取細(xì)胞總蛋白。分別將40 μg不溶的Lys-type PGN或Dap-type PGN與100 μL總蛋白低溫孵育3—4h后，離心除去未結(jié)合的蛋白， 重懸洗滌4次后通過Western-blotting檢測(cè)蛋白結(jié)合情況。

1.7 酰胺酶活性分析

HEK293T細(xì)胞接種到25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(5×106—1×107/瓶)并在培養(yǎng)過夜后， 將10 μg p3×FLAG或PGRP-S-FLAG轉(zhuǎn)染到細(xì)胞之中，36—48h后提取細(xì)胞總蛋白。分別將40 μg不溶的Lys-type PGN或Dap-type PGN與50 μg p3xFLAG或PGRP-S-FLAG總蛋白加入到Tris-ZnCl2緩沖液中(20 mmol/L Tris-HCl， 150 mmol/L NaCl， 10 μmol/L ZnCl2， pH7.2)， 室溫孵育120min， 每10min用全波長(zhǎng)分光光度計(jì)讀取λ540的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 大鯢PGRP-S 開放閱讀框及其編碼的氨基酸序列

大鯢PGRP-S的ORF長(zhǎng)495bp， 編碼165個(gè)氨基酸， 在其53—161氨基酸處含有一個(gè)保守的PGRP結(jié)構(gòu)域。SignalP軟件分析， 大鯢PGRP-S的N端不含有信號(hào)肽。通過ClustalX1.8對(duì)大鯢PGRP-S和其他物種的PGRPs氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析， 發(fā)現(xiàn)大鯢PGRP-S具有2個(gè)相距較近的半胱氨酸殘基， 而這2個(gè)半胱氨酸對(duì)于PGRP的功能和結(jié)構(gòu)完整性都是十分重要的[5，10，16]。此外， 大鯢PGRP-S具有保守的2個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)(H83和Y117)。

MatGat2.0相似性比對(duì)顯示大鯢PGRP-S與其他物種的PGRPs相似性在19.1%—50.5%， 其中與非洲爪蟾PGLYRP1相似性最高， 為50.5%； 其次是熱帶爪蟾和牛的PGLYRP1， 分別為45.1%和42.1%； 與鯉科魚類短型PGRP5的相似性為29.8%—36.1%； 與其他脊椎動(dòng)物長(zhǎng)型PGRP2和PGRP6的相似性為19.1%—22.4% (表 1)。

2.2 大鯢PGRP-S系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用MEGA4.0軟件鄰接法構(gòu)建大鯢PGRP-S和其他脊椎動(dòng)物PGRPs的系統(tǒng)進(jìn)化樹， 結(jié)果表明大鯢PGRP-S與兩棲動(dòng)物爪蟾的短型肽聚糖識(shí)別蛋白PGLYRP1的親緣關(guān)系最近； 同時(shí)哺乳動(dòng)物短型PGLYRP1與中間型PGLYRP-3和PGLYRP-4聚為一個(gè)大的分支(圖 1)。

2.3 大鯢PGRP-S真核表達(dá)產(chǎn)物免疫印跡檢測(cè)

由于HEK293T細(xì)胞高的轉(zhuǎn)染效率， 我們以HEK293T細(xì)胞作為模型研究大鯢PGRP-S的功能。用重組質(zhì)粒PGRP-S-FLAG以及相應(yīng)的空質(zhì)粒p3xFLAG轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞36h后提取蛋白， 經(jīng)SDS-PAGE電泳后， 轉(zhuǎn)PVDF膜， Western-blotting分析結(jié)果顯示HEK293T細(xì)胞的胞外培養(yǎng)基以及細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中在15—25 kD有特異性條帶， 與目的蛋白理論分子量大小一致(18 kD左右)， 而空質(zhì)粒p3xFLAG轉(zhuǎn)染組無特異性條帶， 表明目的蛋白在HEK293T細(xì)胞胞外和胞內(nèi)都有表達(dá)。

表 1 大鯢PGRP-S與其他物種的PGRPs氨基酸序列相同性/相似性比較Tab. 1 Amino acid identities/similarities of Andrias davidianus PGRP-S and those of other species

2.4 大鯢PGRP-S的NF-κB活性分析

NF-κB信號(hào)通路是肽聚糖識(shí)別蛋白識(shí)別病原微生物繼而產(chǎn)生抗菌效應(yīng)的重要通路， 果蠅PGRPs家族許多成員均可通過此信號(hào)通路誘導(dǎo)抗菌肽的產(chǎn)生[17，18]。為了研究大鯢PGRP-S是否能激活NF-κB信號(hào)通路， 我們將大鯢PGRP-S及空質(zhì)粒分別與NF-κB啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，48h后裂解細(xì)胞。該熒光素酶檢測(cè)的結(jié)果表明， 大鯢PGRP-S能顯著激活NF-κB啟動(dòng)子活性(圖 2)。

2.5 大鯢PGRP-S的抗菌作用

為了研究大鯢PGRP-S對(duì)胞外以及胞內(nèi)遲緩愛德華氏菌增殖的影響， 我們將PGRP-S-FLAG質(zhì)粒及空質(zhì)粒p3xFLAG轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞， 然后用遲緩愛德華氏菌感染過表達(dá)的細(xì)胞， 分別在感染后3h和6h收集細(xì)胞培養(yǎng)基或者裂解物， 通過平板計(jì)數(shù)法來計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外遲緩愛德華氏菌的數(shù)量。結(jié)果顯示， 在遲緩愛德華氏菌感染3h和6h后， 實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(圖 3)。

2.6 大鯢PGRP-S的肽聚糖結(jié)合活性

肽聚糖識(shí)別蛋白， 作為天然免疫系統(tǒng)中的一類模式識(shí)別受體， 因其能特異性地識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁組分PGN而得名。為了研究大鯢的PGRP-S與PGN的結(jié)合情況， 我們?cè)贖EK293T細(xì)胞中分別過表達(dá)大鯢PGRP-S的FLAG標(biāo)簽融合蛋白以及GFP蛋白， 并將胞漿蛋白提取物分別與Lys-type和Dap-type PGN共孵育， 再通過Western-blotting技術(shù)檢測(cè)大鯢PGRP-S與這2種PGN的結(jié)合情況。結(jié)果表明， 大鯢PGRP-S能結(jié)合Lys-type和Dap-type PGN (圖 4)。

2.7 大鯢PGRP-S的酰胺酶活性

肽聚糖識(shí)別蛋白家族的部分成員與T7溶菌酶相似， 具有酰胺酶活性， 通過切割MurNAc與LAla之間的酰胺鍵水解細(xì)菌細(xì)胞壁的PGN。為了研究大鯢PGRP-S是否具有酰胺酶活性， 我們?cè)贖EK293T細(xì)胞中過表達(dá)大鯢PGRP-S的重組質(zhì)粒， 并將蛋白提取物分別與Lys-type和Dap-type PGN在Tris-Zn-Cl2緩沖液中共孵育， 用全波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)OD540的變化。結(jié)果表明， 大鯢PGRP-S沒有酰胺酶活性， 不能水解Lys-type和Dap-type PGN (圖 5)。

3 討論

圖 1 鄰接法構(gòu)建大鯢PGRP-S與其他物種PGRPs的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Andrias davidianus PGRP-S with those of other species

圖 2 大鯢PGRP-S對(duì)NF-κB啟動(dòng)子活性的影響Fig. 2 The effect of Andrias davidianus PGRP-S on the NF-κB activity

肽聚糖識(shí)別蛋白家族成員既可編碼分泌蛋白，又可編碼膜蛋白或者胞內(nèi)蛋白。在果蠅中， 幾乎所有短型PGRPs均為分泌蛋白； 其中PGRP-SA和PGRP-SD起著模式識(shí)別受體的作用， PGRP-SB和PGRP-SC則具有水解PGN的酰胺酶活性[19]。哺乳動(dòng)物的4個(gè)PGRPs均為分泌蛋白， 它們分別表達(dá)于不同的組織， 參與該組織的免疫應(yīng)答[4]。在魚類中，斑馬魚的PGLYRP2、PGLYRP5和PGLYRP6及草魚的PGLYRP6也均能分泌到胞外[8，13]。本研究中的大鯢PGRP-S盡管沒有信號(hào)肽， 但也能分泌到胞外， 這與斑馬魚PGLYRP5的情況類似[8]。這表明PGRPs家族成員具有不依賴于信號(hào)肽的分泌機(jī)制。

圖 3 大鯢PGRP-S對(duì)胞內(nèi)(A)以及胞外(B)遲緩愛德華氏菌增殖的影響Fig. 3 The effect of Andrias davidianus PGRP-S on the intracellular (A) and extracellular (B) E.tarda’s growth in HEK293T cells

圖 4 大鯢PGRP-S與PGN的結(jié)合作用Fig. 4 The binding activity of Andrias davidianus PGRP-S with PGN

肽聚糖識(shí)別蛋白最初因能識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的PGN而得名， 目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)PGRPs均具有PGN結(jié)合能力， 并且這種結(jié)合活性可能并不依賴于PGRP結(jié)構(gòu)域的完整性[14]。已有的研究顯示， PGRPs對(duì)于Lys-type和Dap-type PGN的結(jié)合能力存在差異；它們區(qū)別Lys和Dap型PGN主要是通過2個(gè)途徑:(1)通過區(qū)別不同類型肽聚糖的四肽尾之間的肽橋；(2)通過肽聚糖結(jié)合大溝內(nèi)的3個(gè)重要的氨基酸的組成區(qū)別不同類型的肽聚糖[20]， 如人類的PGLYRP1(Gly89、Trp90和Arg109GWR)識(shí)別Dap型PGN； PGLYRP3(Asn236、Phe237和Val256NFV)識(shí)別Lys型PGN[5]， 草魚PGLYRP5(Gly73、Phe74和Arg93GFR)識(shí)別2種類型的PGN[12]。在本研究中， 大鯢PGRP-S (Lys111、Arg112和Arg131KRR)也識(shí)別2種類型的PGN。此外， 在其他的物種中這3個(gè)位點(diǎn)還存在其他不同的氨基酸組成， 這些不同的氨基酸組成與PGN結(jié)合特異性之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

目前發(fā)現(xiàn)的PGRPs成員幾乎都參與天然免疫應(yīng)答， 它們的功能概括起來主要包括三個(gè)方面:(1)作為模式識(shí)別受體(如果蠅的PGRP-SA)， 激活下游的免疫應(yīng)答信號(hào)通路， 介導(dǎo)抗菌肽等效應(yīng)分子的釋放； (2)作為效應(yīng)分子， 具有直接的殺菌作用， 如哺乳動(dòng)物的PGLYRP1、PGLYRP3、PGLYRP4； (3)作為調(diào)節(jié)分子， 調(diào)節(jié)免疫信號(hào)通路的應(yīng)答水平: 包括具有酰胺酶活性的PGRPs (如PGRP-LB)和一些PGRPs分子的異構(gòu)體(如rPGRP-LC)[16，19，21]。本研究發(fā)現(xiàn)在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)大鯢PGRP-S能抑制E. tarda在胞內(nèi)的增殖， 這與之前Li等[13]和Yu等[14]在草魚CIK細(xì)胞中對(duì)草魚PGRP6及其異構(gòu)體的研究結(jié)果類似， 與之不同的是我們還發(fā)現(xiàn)大鯢PGRP-S對(duì)E.tarda的胞外增殖也具有抑制作用， 這表明大鯢的PGRP-S在抵抗胞內(nèi)和胞外細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答中都具有重要作用。

NF-κB作為無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的天然免疫系統(tǒng)乃至適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子， 參與多個(gè)免疫信號(hào)通路的激活。昆蟲中2個(gè)重要的抗菌天然免疫信號(hào)通路(Toll和IMD)以及脊椎動(dòng)物中其他的PRRs (如TLRs和NODs)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答信號(hào)通路都涉及NF-κB的活化。Li等[13]和Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)， 在草魚頭腎細(xì)胞中過表達(dá)草魚PGRP6及其異構(gòu)體能激活NF-κB信號(hào)通路。而本研究發(fā)現(xiàn)， 在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)大鯢的PGRPS也能誘導(dǎo)NF-κB啟動(dòng)子的活性， 我們推測(cè)大鯢PGRP-S可能和魚類一樣， 通過激活NF-κB相關(guān)的免疫信號(hào)通路發(fā)揮抗菌功能。

圖 5 大鯢PGRP-S的酰胺酶活性分析Fig. 5 Amidase activity of Andrias davidianus PGRP-S

在肽聚糖識(shí)別蛋白家族中， 有的PGRPs具有酰胺酶活性， 如果蠅PGRP-SB1、PGRP-LB， 哺乳動(dòng)物PGLYRP2等[22—24]。目前發(fā)現(xiàn)的所有具有酰胺酶活性的PGRPs均含有4個(gè)保守的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)， 如斑馬魚PGLYRP5(His98、Tyr132、His206和Cys214，HYHC)[8]。Zn2+在PGRPs水解PGN的過程中作為親電催化劑， 促進(jìn)N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵的水解[25]。因此， 這4個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)具有催化活性的PGRPs至關(guān)重要， 人類PGLYRP2C530S突變及果蠅PGRP-SC1b C168A和C168S突變均失去酰胺酶活性[26，27]。本研究發(fā)現(xiàn)， 只有2個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)的大鯢PGRP-S不具有酰胺酶活性， 這表明所克隆的大鯢PGRP-S類似于哺乳動(dòng)物的PGLYRP1、PGLYRP3和PGLYRP4， 能結(jié)合但不能直接降解細(xì)菌的肽聚糖； 其殺菌機(jī)制有可能是因?yàn)榕c細(xì)菌細(xì)胞壁的相互作用抑制了肽聚糖的合成， 進(jìn)而殺死細(xì)菌或者抑制細(xì)菌的增殖[28，29]。

總之， 本研究克隆了大鯢的一個(gè)短型肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-S， 在其氨基酸序列中只含有2個(gè)保守的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)。功能研究發(fā)現(xiàn)， 大鯢PGRP-S無酰胺酶活性， 但能識(shí)別并結(jié)合Lys型及Dap型PGN， 對(duì)胞內(nèi)及胞外的細(xì)菌具有顯著的抑菌作用， 這說明本研究中所克隆的大鯢PGRP-S在功能上更類似于哺乳動(dòng)物的短型PGRP。

參考文獻(xiàn):

[1] Yoshida H， Kinoshita K， Ashida M. Purification of a peptidoglycan recognition protein from hemolymph of the silkworm，Bombyxmori[J].Journal of Biological Chemistry， 1996， 271(23): 13854—13860

[2] Werner T， Liu G， Kang D，et al. A family of peptidoglycan recognition proteins in the fruit flyDroso-phila melanogaster[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2000， 97(25): 13772—13777

[3] Christophides G K， Zdobnov E， Barillas-Mury C，et al.Immunity-related genes and gene families inAnopheles gambiae[J].Science， 2002， 298(5591): 159—165

[4] Liu C， Xu Z， Gupta D，et al. Peptidoglycan recognition proteins a novel family of four human innate immunity pattern recognition molecules [J].Journal of Biological Chemistry， 2001， 276(37): 34686—34694

[5] Dziarski R， Gupta D. The peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) [J].Genome Biology， 2006， 7(8): 232

[6] Ni D， Song L， Wu L，et al. Molecular cloning and mRNA expression of peptidoglycan recognition protein (PGRP)gene in bay scallop (Argopectenirradians， Lamarck 1819)[J].Developmental & Comparative Immunology， 2007，31(6): 548—558

[7] Coteur G， Mellroth P， De Lefortery C，et al. Peptidoglycan recognition proteins with amidase activity in early deuterostomes (Echinodermata) [J].Developmental &Comparative Immunology， 2007， 31(8): 790—804

[8] Li X， Wang S， Qi J，et al. Zebrafish peptidoglycan recognition proteins are bactericidal amidases essential for defense against bacterial infections [J].Immunity， 2007，27(3): 518—529

[9] Qi Z T， Zhang Q H， Wang Z S，et al. Cloning and expression analysis of a long type peptidoglycan recognition protein (PGRP-L) fromXenopus tropicalis[J].Zoological Research， 2011， 32(4): 371

[10] Dziarski R， Gupta D. Review: Mammalian peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) in innate immunity [J].Innate Immunity， 2010， 16(3): 168

[11] Chang M X， Nie P， Wei L L. Short and long peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) in zebrafish，with findings of multiple PGRP homologs in teleost fish[J].Molecular Immunology， 2007， 44(11): 3005

[12] Li J H， Chang M X， Xue N N，et al. Functional characterization of a short peptidoglycan recognition protein，PGRP5 in grass carpCtenopharyngodon idella[J].Fish &Shellfish Immunology， 2013， 35(2): 221—230

[13] Li J H， Yu Z L， Xue N N，et al. Molecular cloning and functional characterization of peptidoglycan recognition protein 6 in grass carpCtenopharyngodon idella[J].De-velopmental & Comparative Immunology， 2014， 42(2):244—255

[14] Yu Z L， Li J H， Xue N N，et al. Expression and functional characterization of PGRP6 splice variants in grass carpCtenopharyngodon idella[J].Developmental & Comparative Immunology， 2014， 47(2): 264—274

[15] Campanella J J， Bitincka L， Smalley J. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences [J].BMC Bioinformatics，2003， 4(1): 29

[16] Royet J， Dziarski R. Peptidoglycan recognition proteins:pleiotropic sensors and effectors of antimicrobial defences [J].Nature Reviews Microbiology， 2007， 5(4):264—277

[17] Takehana A， Katsuyama T， Yano T，et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor， peptidoglycan-recognition protein-LE， activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade inDrosophila larvae[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002， 99(21): 13705—13710

[18] Gobert V， Gottar M， Matskevich A A，et al. Dual activation of the Drosophila toll pathway by two pattern recognition receptors [J].Science， 2003， 302(5653): 2126—2130

[19] Royet J， Gupta D， Dziarski R. Peptidoglycan recognition proteins: modulators of the microbiome and inflammation [J].Nature Reviews Immunology， 2011， 11(12):837—851

[20] Swaminathan C P， Brown P H， Roychowdhury A，et al.Dual strategies for peptidoglycan discrimination by peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) [J].Proceedingsof the National Academy of Sciences， 2006， 103(3):684—689

[21] Neyen C， Runchel C， Schüpfer F，et al. The regulatory isoform rPGRP-LC induces immune resolution via endosomal degradation of receptors [J].Nature Immunology，2016， 17(10): 1150—1158

[22] Zhang Y， Van Der Fits L， Voerman J S，et al. Identification of serum N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase as liver peptidoglycan recognition protein 2 [J].Biochimicaet Biophysica Act (BBA)-Proteins and Proteomics，2005， 1752(1): 34—46

[23] Mellroth P， Steiner H. PGRP-SB1: an N-acetylmuramoyl L-alanine amidase with antibacterial activity [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2006， 350(4): 994—999

[24] Zaidman-Rémy A， Hervé M， Poidevin M，et al. TheDrosophila amidasePGRP-LB modulates the immune response to bacterial infection [J].Immunity， 2006， 24(4):463—473

[25] Guan R， Roychowdhury A， Ember B，et al. Structural basis for peptidoglycan binding by peptidoglycan recognition proteins [J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2004， 101(49): 17168

[26] Mellroth P， Karlsson J， Steiner H. A scavenger function for a drosophila peptidoglycan recognition protein [J].Journal of Biological Chemistry， 2003， 278(9): 7059—7064

[27] Wang Z M， Li X， Cocklin R R，et al. Human peptidoglycan recognition protein-L is an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase [J].Journal of Biological Chemistry，2003， 278(49): 49044—49052