Micro-Tom番茄轉(zhuǎn)基因植株再生體系的優(yōu)化

邱 實(shí),張文舉, 許馥慧,鄧志瑞

番茄(Solanum lycopersicum)作為重要的模式植物,其基因組大小為950 Mbp,共編碼35 000個基因,遺傳學(xué)背景較為清楚.Micro-Tom是一種番茄突變體,具有生命周期短、株型矮小,比普通番茄更適合用于遺傳轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)[1-2].但與其他植物一樣,Micro-Tom在遺傳轉(zhuǎn)化后往往出現(xiàn)愈傷組織和再生植株誘導(dǎo)頻率下降的問題.這主要與所使用的遺傳轉(zhuǎn)化條件和植株再生體系有關(guān).

有研究表明,外植體的選用對于愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生有較大的差異.卡那霉素常被用來篩選轉(zhuǎn)基因陽性候選植株,但過高濃度的卡那霉素也會對候選植株的生長造成影響.不同的外植體所適用的濃度有所不同[3],一般用量為100～200 mg/L[4].在遺傳轉(zhuǎn)化體系中,往往選用羧芐青霉素或頭孢霉素作為抑菌抗生素,用于抑制多余農(nóng)桿菌和雜菌的生長,但因用量較大,在一定程度上也會抑制外植體的生長[5].替門汀作為相對較新的抑菌抗生素,其抑菌應(yīng)用在選擇培養(yǎng)過程中還處于早期嘗試階段.

本實(shí)驗(yàn)選用番茄Micro-Tom的子葉和下胚軸作為外植體,以愈傷組織發(fā)生和不定芽的生長作為指標(biāo),對植物激素配比、預(yù)培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)時間、抗生素濃度等參數(shù)進(jìn)行了探索,初步建立了番茄Micro-Tom的遺傳轉(zhuǎn)化體系,為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

外植體來源與選擇.首先將Micro-Tom種子(PanAmerican Seed公司)依次用75%乙醇、20%次氯酸鈉和無菌水進(jìn)行滅菌處理,然后將種子置于種子萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2MS+3%蔗糖+0.2%植物凝膠)中進(jìn)行培養(yǎng).1周后種子萌發(fā)并生長到子葉期.選取幼苗子葉和下胚軸,分別切成0.5 cm2的葉盤和0.5 cm的莖段,置于預(yù)培養(yǎng)基中,使切口接觸培養(yǎng)基.

菌種、質(zhì)粒與引物.用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌株為ATHV(KWS種子公司),載體質(zhì)粒為含抗卡那霉素的nptⅡ基因pGPTV-ESK1i(KWS種子公司).根據(jù)載體質(zhì)粒的外源DNA片段(同一片段正向和反向插入在不同的位置)序列設(shè)計(jì)了用于鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株的一對引物(由上海生工生物工程公司合成).正向引物p RNAintroF序列為5’-GGAAAATGTCGTGTTGTGGTC-3’;反向引物p RNAiterR序列為5’-CCTGCAGGTCACTGGATT-3’.兩個引物間的片段長度為720 bp,如果其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物長度為720 bp,就說明攜帶外源基因的質(zhì)粒進(jìn)入了植物組織.

培養(yǎng)基的制備.MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基購自于Phyto Technology公司;蔗糖、植物凝膠、吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)、玉米素(zeatin,ZT)、卡那霉素、替門汀等均購自于上海生工生物工程公司.激素和抗生素采用過濾滅菌,在培養(yǎng)基滅菌后且未冷卻時加入.預(yù)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的基本組分均為MS+3%蔗糖+0.2%植物凝膠.

農(nóng)桿菌的制備與侵染.將攜帶表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落置于YEB培養(yǎng)基中,28°C黑暗條件下震蕩培養(yǎng).OD600=1.0時收集菌體,懸浮于MS培養(yǎng)基中.侵染預(yù)培養(yǎng)后的外植體10 min,并用無菌濾紙吸去外植體表面的多余菌液.將侵染后的外植體置于共培養(yǎng)基上,28°C避光培養(yǎng).

轉(zhuǎn)基因植株的鑒定.DNA提取使用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程公司),PCR反應(yīng)使用即用型PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ZT濃度對愈傷組織發(fā)生和不定芽生長的影響

選取IAA作為組織培養(yǎng)的生長素,ZT作為細(xì)胞分裂素.培養(yǎng)基中保持IAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L不變[6],同時加入不同濃度的ZT進(jìn)行配比組合.將子葉和下胚軸外植體置于培養(yǎng)基中,在溫度25°C,光照強(qiáng)度6 000 lx,光周期16 h條件下進(jìn)行培養(yǎng).對比不同ZT濃度下愈傷組織和不定芽的生長情況,確定適宜愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的ZT濃度.

1.2.2 不同外植體愈傷組織形成和再分化的差異

將子葉和下胚軸外植體置于MS培養(yǎng)基中,在溫度25°C,光照強(qiáng)度6 000 lx,光周期16 h條件下進(jìn)行培養(yǎng).每14 d將外植體繼代一次,連續(xù)培養(yǎng)6周.每天觀察并記錄生長情況.

1.2.3 預(yù)培養(yǎng)時間對外植體不定芽生長的影響

在溫度25°C,光照強(qiáng)度6 000 lx,光周期16 h條件下培養(yǎng)子葉外植體.分別在培養(yǎng)0,3,5和7 d后用農(nóng)桿菌侵染,然后共培養(yǎng)和選擇培養(yǎng).待出芽情況穩(wěn)定后,統(tǒng)計(jì)出芽的外植體數(shù)量,計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率.

1.2.4 共培養(yǎng)時間對外植體不定芽生長的影響

將5組經(jīng)過侵染的子葉外植體分別共培養(yǎng)1,2,3,4和5 d.每天觀察外植體生長及農(nóng)桿菌污染情況,將未長出農(nóng)桿菌菌苔的子葉外植體轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).待出芽情況穩(wěn)定(大約14 d)后,統(tǒng)計(jì)出芽的外植體數(shù)量,計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率.凡是共培養(yǎng)之后出現(xiàn)農(nóng)桿菌的就認(rèn)為是被污染,并計(jì)算污染率.

1.2.5 抗生素對愈傷組織發(fā)生和不定芽生長的影響

將外植體直接接種到含不同濃度卡那霉素的MS培養(yǎng)基上.待出芽情況穩(wěn)定后,統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率,確定番茄遺傳轉(zhuǎn)化中用于篩選陽性株的卡那霉素濃度.

將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后的外植體,轉(zhuǎn)至含不同濃度替門汀的MS培養(yǎng)基上,在溫度25°C,光照強(qiáng)度6 000 lx,光周期16 h條件下進(jìn)行培養(yǎng).根據(jù)外植體不定芽誘導(dǎo)率,確定番茄遺傳轉(zhuǎn)化中用于抑菌的替門汀濃度.

1.2.6 再生植株的獲得

根據(jù)1.2.1～1.2.5節(jié)所確定的實(shí)驗(yàn)條件,待不定芽長成2～3 cm的幼苗時,單獨(dú)切下,轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L IBA+3%蔗糖+0.2%植物凝膠)上,每個培養(yǎng)瓶放置1～2株.取生根的幼苗,洗凈根部的瓊脂后,移栽于裝有草炭、蛭石和珍珠巖(體積比為3∶1∶1)的花盆中,并在上面加蓋保濕薄膜,保持3～5 d,再逐漸揭去保濕薄膜,得到初步煉苗成功的番茄植株.將幼苗移至土壤中進(jìn)行培養(yǎng),直至生長穩(wěn)定.

1.2.7 轉(zhuǎn)基因陽性候選植株的鑒定

隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)基因陽性候選植株的葉片,按照DNA抽提試劑盒說明書提取DNA,并使用引物p RNAiterR和pRNAintroF進(jìn)行PCR鑒定.PCR反應(yīng)程序如下:首先94°C預(yù)變性5 min;然后以94°C變性30 s、55°C退火30 s、72°C延伸30 s為一個循環(huán),共進(jìn)行35個循環(huán);最后72°C延伸10 min.

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率的計(jì)算如式(1)和(2)所示.每組實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)90個外植體,重復(fù)3次.顯著性分析方法選用鄧肯新復(fù)極差測驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 ZT濃度對愈傷組織發(fā)生和不定芽生長的影響

在不同的ZT濃度下,子葉和下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的情況如表1所示.可以看出,子葉和下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率隨ZT濃度的增加而升高,但不定芽誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢.這說明在一定濃度范圍內(nèi),較高濃度的ZT有利于不定芽的分化,但ZT濃度過高對不定芽的誘導(dǎo)卻產(chǎn)生了抑制作用.由表1可見,當(dāng)ZT質(zhì)量濃度在0.5 mg/L時,子葉和下胚軸的不定芽誘導(dǎo)率都是最高的,與0.2 mg/L ZT組和2.0 mg/L ZT組存在顯著差異.結(jié)果表明,不定芽分化適宜的培養(yǎng)基激素配比為1.0 mg/L IAA+0.5 mg/L ZT.

表1 ZT濃度對愈傷組織形成和再分化的影響Table 1 Effects of ZT concentrations on callus formation and redifferentiation

2.2 不同外植體愈傷組織形成和再分化的差異

在同樣條件下,子葉和下胚軸愈傷組織的形成和再分化有一定的差異(見表2),在愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)以及生根所需時間上,前者都少于后者,分別為29和35 d(前者比后者少了近六分之一).根據(jù)表1和2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確定,子葉比下胚軸更適合作為遺傳轉(zhuǎn)化體系所使用的外植體.

表2 愈傷組織形成和再分化所需要的培養(yǎng)時間Table 2 Time needed for callus formation and redifferentiation d

2.3 預(yù)培養(yǎng)時間對不定芽生長的影響

表3為預(yù)培養(yǎng)天數(shù)對不定芽生長的影響.可見,預(yù)培養(yǎng)3 d的外植體不定芽誘導(dǎo)率明顯高于預(yù)培養(yǎng)0,5和7 d,且分別是預(yù)培養(yǎng)0 d的2.7倍,以及預(yù)培養(yǎng)5,7 d的1.7倍.這說明不經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)時間過長均不利于不定芽的形成.因此,用于轉(zhuǎn)化的外植體預(yù)培養(yǎng)的適宜時間為3 d.

表3 預(yù)培養(yǎng)時間對不定芽生長的影響Table 3 Effects of preculture time on adventitous bud growth

2.4 共培養(yǎng)時間對不定芽生長的影響

經(jīng)過14 d的選擇培養(yǎng),外植體不定芽誘導(dǎo)率及農(nóng)桿菌污染率如表4所示.可以看出:共培養(yǎng)2 d的外植體的不定芽誘導(dǎo)率最高,達(dá)26.3%,且沒有出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染;共培養(yǎng)3 d或更長時間的外植體,從共培養(yǎng)的第3天起,子葉切口處就開始褐化,培養(yǎng)基出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌落,不定芽誘導(dǎo)率降低.分析該現(xiàn)象的原因,可能是由于過度生長的農(nóng)桿菌嚴(yán)重影響了外植體的生長,導(dǎo)致不定芽誘導(dǎo)率快速下降.而當(dāng)共培養(yǎng)少于2 d時,農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞不能有效轉(zhuǎn)化,不定芽誘導(dǎo)率更低.根據(jù)上述結(jié)果,在遺傳轉(zhuǎn)化過程中,適宜的共培養(yǎng)時間為2 d.

表4 共培養(yǎng)時間對不定芽生長的影響Table 4 Effects of co-culture time on adventitous bud growth

2.5 抗生素對不定芽生長的影響

抗生素對不定芽生長影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5和6所示,其中CK表示對照組.從表5可以看出:隨著卡那霉素濃度的增加,子葉外植體的不定芽誘導(dǎo)率顯著下降;當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到40 mg/L時,子葉外植體生長停止,不定芽誘導(dǎo)率為0.根據(jù)上述結(jié)果,確定用于篩選抗性不定芽的卡那霉素濃度下限為40 mg/L.

表5 卡那霉素對不定芽生長的影響Table 5 Effects of kanamycin on adventitous bud growth

由表6可知,外植體的不定芽誘導(dǎo)率隨替門汀濃度的增加呈先升高后降低的趨勢.當(dāng)替門汀濃度較低時,培養(yǎng)基會出現(xiàn)較為明顯的農(nóng)桿菌污染.隨著替門汀濃度的增加,污染率逐漸降低.當(dāng)濃度達(dá)到150 mg/L時,替門汀可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長,同時不定芽誘導(dǎo)率也最高.根據(jù)上述結(jié)果,確定遺傳轉(zhuǎn)化過程中用于抑菌目的的替門汀的適宜濃度為150 mg/L.

表6 替門汀對不定芽生長的影響Table 6 Effects of timentin on adventitous bud growth

2.6 再生植株的獲得

圖1 Micro-Tom番茄遺傳轉(zhuǎn)化的不同生長階段Fig.1 Different growth stages of Micro-Tom tomato for genetic transformation

再生植株的獲得經(jīng)歷了愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽發(fā)生、生根、生根后的移栽和煉苗等多個過程,整個培養(yǎng)過程的典型結(jié)果如圖1所示,其中種子萌發(fā)培養(yǎng)基組分為1/2MS+3%蔗糖+0.2%植物凝膠,預(yù)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基組分為MS+3%蔗糖+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/L IAA+0.2%植物凝膠,選擇培養(yǎng)基組分為MS+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/L IAA+40 mg/L卡那霉素+150 mg/L替門汀+3%蔗糖+0.2%植物凝膠,生根培養(yǎng)基組分為MS+1.0 mg/L IBA+3%蔗糖+0.2%植物凝膠.

2.7 轉(zhuǎn)基因陽性候選植株的鑒定

以T0轉(zhuǎn)基因植株的總DNA為模板,用引物pRNAiterR和pRNAintroF進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果如圖2所示,其中1為空白對照,2為陽性對照,3～10為T0轉(zhuǎn)基因候選植株,M為DM5000 marker.可見,轉(zhuǎn)基因陽性植株擴(kuò)增出與陽性對照相同的720 bp的目的片段,未擴(kuò)增出任何條帶的為假陽性植株.根據(jù)上述結(jié)果,初步確定目的基因已整合到Micro-Tom番茄基因組中.

圖2 T0轉(zhuǎn)基因番茄目標(biāo)基因的PCR檢測Fig.2 PCR detection of target gene in T0 transgenic tomato

3 討論

植物不同組織器官因分化程度和生理生化基礎(chǔ)不同,其脫分化和再生潛能也有所區(qū)別.在番茄上已有用根、葉、花藥、子葉和下胚軸進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得再生植株的報(bào)道[7-8].有研究表明,由番茄花藥等分化程度較高的組織培養(yǎng)形成愈傷組織的分化率不高,而利用根培養(yǎng)則對培養(yǎng)基中必需元素的要求非常嚴(yán)格[9].番茄的子葉和下胚軸作為外植體均能形成完整植株.雖然子葉、下胚軸的成苗明顯優(yōu)于其他外植體,但成苗的早晚和正常苗的比率有很大差異[10].本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了子葉和下胚軸作為番茄組織培養(yǎng)外植體的差異,發(fā)現(xiàn)在同樣的激素配比條件下,子葉的不定芽誘導(dǎo)率高于下胚軸,并且子葉形成愈傷組織的時間、出芽時間和生根時間均少于下胚軸.

在組織培養(yǎng)過程中,外源植物激素的使用必不可少.許多學(xué)者對不同激素配比和濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),但因激素種類和配比差異較大,結(jié)果不盡一致.外植體分化芽的能力除了要求一定的激素濃度外,更取決于培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素的種類和比例.在番茄的再生體系研究中,最常見的細(xì)胞分裂素為ZT和6-芐基腺嘌呤(6-benzyl aminopurine,6-BA)[11].陳麗萍等[12]和歐陽波等[13]的研究表明,在番茄再生體系中,ZT的效果好于6-BA,其一般用量為0.1～2.0 mg/L.番茄再生體系研究常選用IAA作為生長素,報(bào)道的用量為0.02～4.00 mg/L[6].本實(shí)驗(yàn)主要研究了ZT作為細(xì)胞分裂素對番茄外植體生長的影響,確定了培養(yǎng)基中ZT和IAA的適宜質(zhì)量濃度分別為0.5和1.0 mg/L.這與已有的激素配比[11]類似,但也有一定的差異.例如王傲雪等[11]認(rèn)為,更高濃度的ZT(2.0 mg/L)和更低濃度的IAA(0.2 mg/L)有利于番茄外植體的不定芽再生,激素濃度的差異也可能是由于實(shí)驗(yàn)所用的番茄品系不同所引起的.

有些植物在轉(zhuǎn)基因再生過程中不需要預(yù)培養(yǎng).例如煙草和豇豆的葉片外植體不論是否經(jīng)過預(yù)培養(yǎng),其轉(zhuǎn)化率均沒有差異.有些植物的外植體在農(nóng)桿菌侵染之前需要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),但對于預(yù)培養(yǎng)時間的長短,目前還沒有定論,通常由基因型和外植體的種類來確定.以番茄葉片作為外植體時,其轉(zhuǎn)化過程中一般需要進(jìn)行2 d的預(yù)培養(yǎng)[14],預(yù)培養(yǎng)后的番茄葉片轉(zhuǎn)化率高于未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的葉片[15].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在Micro-Tom的遺傳轉(zhuǎn)化過程中,預(yù)培養(yǎng)時間為3 d時對不定芽誘導(dǎo)最有利.這與之前報(bào)道的2 d時間有所差別,但比較接近.推測產(chǎn)生這種差異的原因是因?yàn)镸icro-Tom與張賽群等[15]研究的番茄品種(A21等)不同.

遺傳轉(zhuǎn)化使用的載體質(zhì)粒通常會攜帶某種抗生素抗性基因,以便于在遺傳轉(zhuǎn)化的選擇培養(yǎng)階段篩選到轉(zhuǎn)化植株.培養(yǎng)基中的抗生素濃度對于篩選結(jié)果至關(guān)重要,既要保證殺滅非轉(zhuǎn)化的外植體,又要保證對轉(zhuǎn)化的材料沒有明顯的影響.因此,在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化前有必要了解外植體對篩選抗生素的耐受能力,確定選擇培養(yǎng)基中加入抗生素的最低濃度,從而實(shí)現(xiàn)殺死未成功轉(zhuǎn)化的外植體并保留轉(zhuǎn)基因外植體的目的.卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素,它通過與植物細(xì)胞器葉綠體和線粒體中的核糖體30S亞基結(jié)合,從而在翻譯過程中干擾蛋白質(zhì)的合成,導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡.在篩選時,非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因不含該抗性基因而被抑制或殺死,而轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于獲得了抗性,可以在含一定濃度的卡那霉素培養(yǎng)基上存活下來[16].張麗華等[3]比較了B01,B02,B03,B04這4個加工番茄品種對卡那霉素的耐受能力.結(jié)果表明,篩選番茄子葉、下胚軸外植體的卡那霉素適宜濃度約為75 mg/L,并且子葉外植體相比下胚軸外植體對卡那霉素更為敏感.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,Micro-Tom子葉外植體對卡那霉素更加敏感,當(dāng)卡那霉素濃度為40 mg/L時,即可完全抑制Micro-Tom子葉外植體的生長.

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中,常使用抑菌抗生素抑制轉(zhuǎn)化后農(nóng)桿菌的生長.因?yàn)楣才囵B(yǎng)后,外植體的表面以及內(nèi)部會殘留農(nóng)桿菌,容易發(fā)生污染,因此對于抑菌抗生素的選擇,原則上要兼顧對農(nóng)桿菌生長的有效抑制和對轉(zhuǎn)化外植體再生的沒有抑制.共培養(yǎng)之后,用于殺滅或抑制農(nóng)桿菌的常用抗生素種類有羧芐青霉素(carbenecillin,Carb)、頭孢霉素(cefotaxime,Cef)、替門汀等,其中Carb和Cef的應(yīng)用最廣泛.通常認(rèn)為Cef可以抑制外植體的不定芽分化,Carb能抑制根的形成[17].替門汀是一種新型的有效抑制農(nóng)桿菌的特效抗生素,其組分為替卡西林鈉及克拉維酸鉀,二者質(zhì)量比為15∶1.克拉維酸鉀單獨(dú)抗菌時作用甚微,這是因?yàn)槎喾N革蘭氏陽性菌(G+)和陰性菌(G?)都能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,這類酶能在青霉素作用于病原體之前將其破壞.替卡西林鈉是一種β-內(nèi)酰胺酶不可逆性高效抑制劑,通過阻斷β-內(nèi)酰胺酶破壞細(xì)菌的防御屏障,恢復(fù)細(xì)菌對克拉維酸鉀的敏感性.因此,克拉維酸鉀與替卡西林鈉配合使用使替門汀成為具有廣譜殺菌作用的抗生素[18].替門汀在抑制農(nóng)桿菌的同時,對于植物材料的影響很小,特別適合較難轉(zhuǎn)化材料的轉(zhuǎn)基因[19].Cheng等[20]的研究結(jié)果表明,替門汀在煙草遺傳轉(zhuǎn)化中的使用濃度一般為500 mg/L左右,但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)替門汀濃度達(dá)到150 mg/L時即可完全抑制外植體表面的農(nóng)桿菌生長.推測原因可能是Cheng等[20]研究中使用的農(nóng)桿菌菌株LBA4404與本實(shí)驗(yàn)中的菌株AHTV對替門汀的敏感程度不同.

4 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了番茄Micro-Tom的轉(zhuǎn)基因再生體系,為Micro-Tom的基因工程研究奠定了基礎(chǔ).除了本實(shí)驗(yàn)中的這些較為重要的因素外,植物遺傳轉(zhuǎn)化還受到許多其他因素的影響.因此,Micro-Tom的遺傳轉(zhuǎn)化體系還需要進(jìn)一步深入研究.