芪藶強(qiáng)心減輕阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟損傷

武曉棟,姜惠敏,姚文明,高蓉蓉,李新立

阿霉素(doxorubicin,DOX)是臨床治療中常用的一種蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物,因其具有作用的廣譜性及療效的確定性,被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療[1-2].然而DOX對(duì)多種器官存在毒性副作用,尤其是心臟毒性作用.這也增加了患者心血管疾病的患病率與死亡率,極大地限制了DOX為臨床應(yīng)用.在用藥開(kāi)始階段心肌損害程度不甚嚴(yán)重時(shí),患者往往沒(méi)有明顯的臨床癥狀;而當(dāng)心肌損害進(jìn)一步發(fā)展出現(xiàn)慢性心力衰竭時(shí),可以出現(xiàn)一系列與心力衰竭相關(guān)的臨床癥狀.一旦出現(xiàn)這些癥狀,患者的病死率可高達(dá)30%～50%[3-5].因此,尋找有效的治療措施對(duì)于改善DOX心肌病的預(yù)后,以及擴(kuò)大DOX臨床應(yīng)用范圍至關(guān)重要.

對(duì)于DOX所致心臟毒性的研究發(fā)現(xiàn),DOX可引發(fā)心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激[6],改變心臟超微結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致DNA損傷,甚至于心肌細(xì)胞的大量凋亡[7],最終導(dǎo)致心肌病的發(fā)生,其中線(xiàn)粒體功能損害被認(rèn)為是DOX心臟毒性的重要組成部分[6-10].

芪藶強(qiáng)心(Qiliqiangxin,QLQX)是在絡(luò)病理論指導(dǎo)下研制的治療慢性心力衰竭的現(xiàn)代特色中藥.已有研究表明,QLQX可以穩(wěn)定心肌細(xì)胞的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu),改善線(xiàn)粒體功能,抑制心肌組織中的氧化應(yīng)激過(guò)程,從而有效調(diào)控心肌能量代謝[11-13].本工作探究了QLQX對(duì)DOX誘導(dǎo)的小鼠心臟損傷的治療作用.

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠,7～9周齡.所有實(shí)驗(yàn)操作均按照南京醫(yī)科大學(xué)的相關(guān)規(guī)定,并通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的審批.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

阿霉素(Sigma);實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)相關(guān)試劑,包括Trizol(Invitrogen)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Rad)、SYBR Green(Bio-Rad)、384孔PCR板(ABI).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

本工作將7～9周齡的C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為兩批:①對(duì)照組(n=5),DOX注射組(n=5);②對(duì)照組(n=5),DOX注射組(n=3),DOX注射+QLQX給藥組(n=4).DOX注射組按照4 mg/kg的劑量向小鼠腹腔注射DOX,每周1次,持續(xù)4周;對(duì)照組則給予同樣劑量的生理鹽水.DOX注射+QLQX給藥組在注射DOX的同時(shí),按照0.5 g/(kg·d)的劑量給予QLQX治療,持續(xù)4周.

1.2.2 心臟超聲檢查

使用2%的異氟烷麻醉小鼠后,通過(guò)Vevo 2100(Visual Sonics Inc)進(jìn)行心臟超聲檢查,評(píng)估各組小鼠的心功能變化.

1.2.3 qRT-PCR

使用Trizol提取心臟組織中的總RNA.定量選取400 ng總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲取樣本cDNA.以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因,利用特異性的引物及SYBR Green進(jìn)行qRT-PCR,以檢測(cè)目標(biāo)基因在樣本中的表達(dá)水平.本工作所使用的引物序列如表1所示.

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示.兩組樣本比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組樣本比較使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并以Bonferroni作兩兩比較,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 List for the primers used for qRT-PCR

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 DOX誘導(dǎo)小鼠心功能損傷

本工作使用Vevo 2100進(jìn)行心臟超聲檢查,評(píng)估DOX對(duì)心臟的毒性作用.結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著DOX累計(jì)注射劑量的增加,小鼠的心功能指標(biāo),包括射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率均明顯降低(見(jiàn)圖1,其中***表示P＜0.001).由此可知,DOX可引起小鼠心功能損傷,使小鼠心功能水平明顯下降.

圖1 注射阿霉素后的小鼠心功能指標(biāo)Fig.1 Injection of DOX induced cardiac dysfunction in mice

2.2 DOX導(dǎo)致的線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈以及DNA損傷

采用qRT-PCR檢測(cè)了小鼠心臟組織中與線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈及DNA損傷相關(guān)的基因的表達(dá)情況,結(jié)果如圖2和3所示,其中*表示P＜0.05,**表示P＜0.01,***表示P＜0.001,n=5.由圖2可知,DOX可以使小鼠心臟組織中與線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈相關(guān)的基因的表達(dá)情況發(fā)生明顯變化,其中Ndufa8與ATP6V1E的表達(dá)明顯升高,而ATP5G1與ATP5H則顯著下降.由圖3可知,DOX在心臟組織誘發(fā)了嚴(yán)重的DNA損傷,其中相關(guān)的ATM,ATR及CHK2的表達(dá)均顯著下降.

圖2 注射阿霉素后,與線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈相關(guān)的基因的表達(dá)Fig.2 Expression of the oxidation respiratory chain-related genes after the injection of DOX

圖3 注射阿霉素后,與小鼠心肌組織相關(guān)的基因表達(dá)Fig.3 Expression of the myocardium related genes in mice after the injection of DOX

2.3 QLQX減輕阿霉素對(duì)小鼠的心功能損傷

本工作使用Vevo 2100進(jìn)行心臟超聲檢查,評(píng)估各組小鼠的心功能狀況,明確QLQX是否能對(duì)小鼠心功能發(fā)揮保護(hù)作用,結(jié)果如圖4所示,其中***表示P＜0.001,n=3～5.可見(jiàn),DOX可引起小鼠射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率的明顯下降,而QLQX可改善上述兩個(gè)指標(biāo),對(duì)DOX所致心臟損傷表現(xiàn)出了一定的保護(hù)作用.

3 討論

越來(lái)越多的研究表明,DOX嚴(yán)重的心臟毒性及其在心臟的蓄積,使患者的心血管事件發(fā)生率隨累積劑量的增加而逐漸增高.但對(duì)于DOX等蒽環(huán)類(lèi)藥物對(duì)機(jī)體器官副作用的拮抗治療研究仍進(jìn)展緩慢[4,14].線(xiàn)粒體損傷被認(rèn)為是DOX所致心臟毒性作用的重要組成部分.DOX的注射可引起線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的改變,阻礙線(xiàn)粒體DNA的合成,影響心臟的能量代謝過(guò)程[1,8,15].本研究結(jié)果也同樣表明了DOX可阻礙線(xiàn)粒體的氧化代謝過(guò)程,引起DNA損傷,使得心臟功能明顯受損.

圖4 QLQX治療后,DOX注射小鼠的心功能狀況Fig.4 Cardiac function in DOX injected mice after QLQX treatment

本工作首先探討了中藥QLQX是否可緩解DOX所致心臟毒性作用.QLQX是在絡(luò)病理論指導(dǎo)下研制的治療慢性心力衰竭的現(xiàn)代特色中藥.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,QLQX可以通過(guò)激活PGC-1α增強(qiáng)線(xiàn)粒體DNA的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過(guò)程,促進(jìn)線(xiàn)粒體的合成,改善線(xiàn)粒體的能量代謝過(guò)程[11-13];經(jīng)過(guò)QLQX給藥治療后,注射DOX小鼠的心功能得到了明顯改善,提示QLQX對(duì)DOX所致心臟損傷具有治療作用.

本工作還存在很多不足之處,比如未能探討QLQX對(duì)于DOX所致心臟損傷保護(hù)作用的相關(guān)分子機(jī)制,但這也為下一步的深入研究提供了方向.總的來(lái)說(shuō),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了QLQX可以減輕DOX誘導(dǎo)的心臟損傷,并為臨床治療DOX所致心臟毒性提供了更多的藥物選擇.