hMAM mRNA表達情況與乳腺癌的關(guān)系

冀峰，呂復(fù)君，李延翠

開封市中心醫(yī)院1乳腺甲狀腺科，2神經(jīng)外科，河南開封4750000

乳腺癌多發(fā)于女性，是威脅人類健康的惡性腫瘤之一[1]，根據(jù)病情的嚴重程度不同，臨床上可選取不同的治療方法，如手術(shù)、放療、化療、靶向治療等。為提高乳腺癌的治療效果，大多數(shù)患者采用乳腺癌局部與全身聯(lián)合治療[2]。目前，臨床上通過監(jiān)測腋窩淋巴結(jié)狀況、原發(fā)癌灶大小、激素受體狀況、原癌基因及抑癌基因的變化，從而預(yù)測乳腺癌病情的嚴重程度。然而乳腺癌術(shù)后可能會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，上述指標對于微轉(zhuǎn)移癌的靈敏度較低，因此，選擇靈敏度高的檢測指標對乳腺癌的病情評估及治療尤其重要[3]。已有研究表明，人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）mRNA在正常細胞中表達較低，在乳腺癌細胞中表達升高[4]，但有關(guān)hMAMmRNA表達與乳腺癌發(fā)病關(guān)系的研究較少。本研究采用巢式-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Nested-RT-PCR）檢測乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA表達情況，旨在探討hMAMmRNA表達與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年1月至2017年3月于開封市中心醫(yī)院治療的乳腺癌患者87例。納入標準：①均經(jīng)病理學(xué)診斷確診；②入組前未行放療或化療等治療。排除標準：合并其他原發(fā)性腫瘤的患者。同時選取70例乳腺良性腫瘤患者和50例健康志愿者。納入標準：①乳腺良性腫瘤患者均經(jīng)病理學(xué)診斷確診；②健康志愿者身體健康。排除標準：①有乳腺癌家族史者；②有乳腺治療史者。乳腺癌患者中，男4例，女83例；年齡（50.43±6.84）歲；乳腺良性腫瘤患者中，男2例，女68例，年齡（49.81±8.03）歲；健康志愿者中，男1例，女49例；年齡（51.03±7.10）歲。3組研究對象的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1hMAMmRNA及內(nèi)參照引物hMAMmRNA上游外引物序列為5′-GAAGTTGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游外引物序列為 5′-CTCACCATACCCTGCAGTTCTGTGAGC-3′，擴增目的片斷長度為324 bp；hMAMmRNA上游內(nèi)引物序列為5′-CTCCCAGCACTGCTACGCAGGCTC-3′，下游內(nèi)引物序列為5′-CACCTCAACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′，擴增目的片段長度為201 bp。PBGD參照物上游引物序列為5′-GACTGGAGGAGTCTGGAGTC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-AATCCCTGGAAGGCTTGAAC-3′，擴增目的片斷長度為186 bp，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成[5]。

1.2.2 標本采集抽取研究對象的肘靜脈血5 ml，加入1/8體積的檸檬酸鈉（武漢博士德生物有限公司）進行抗凝，采用淋巴細胞分離液（上海研謹生物有限公司）分離單個核細胞，在德國徠卡DMI4000倒置顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)為5×106個。采用Trizol試劑盒（百泰克生物有限公司）抽提細胞總RNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。采用德國耶拿SPE-KOL1300紫外分光光度計測量260 nm和280 nm處的吸光度值（A值），A260/A280在1.8～2.0為質(zhì)量合格的RNA，可用于后續(xù)實驗[6]。

1.2.3 Nested-RT-PCR 抽提細胞總RNA，第1步進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），采用Promega公司提供的試劑盒，反應(yīng)體系如下：0.1 U/μl的鳥類成髓細胞性白細胞病毒（AMV）反應(yīng)緩沖液10 μl，0.5 mmol/L的上游外及下游外引物各1 μl，0.2 mmol/L的dNTP1 μl，0.1 U/μl的DNA聚合酶1 μl，2 μg RNA，加去離子水至總反應(yīng)體積 50 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、3 min（預(yù)變性），94 ℃、30 s（變性），58 ℃、1 min（退火），68 ℃、1.5 min（擴增），共35個循環(huán)；70℃、7 min（延伸）。第2步反應(yīng)體系如下：AMV反應(yīng)緩沖液10 μl，0.5 mmol/L的上游內(nèi)及下游內(nèi)引物各 1 μl，0.2 mmol/L 的 dNTP 1 μl，0.1 U/μl的DNA聚合酶1 μl，取第1次反應(yīng)產(chǎn)物2 μl，加去離子水至總體積50 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、3 min（預(yù)變性），94 ℃、30 s（變性），59 ℃、1 min（退火），68 ℃、1 min（擴增），共35個循環(huán)；70 ℃、7 min（延伸）[7]。1.2.4結(jié)果觀察對PCR擴增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色顯示DNA條帶，紫外線下顯像，201 bp處出現(xiàn)DNA條帶時為陽性結(jié)果。

1.3 治療方法

乳腺癌良性腫瘤患者均經(jīng)MMT（Mammotome）微創(chuàng)手術(shù)治療；Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者行保乳/改良根治術(shù)治療，Ⅲ期乳腺癌患者行多西他賽+表柔比星+環(huán)磷酰胺（TEC）方案輔助化療；Ⅳ期乳腺癌患者行長春瑞濱+順鉑（NP）或長春瑞濱+卡培他濱（NX）方案姑息化療。分別于化療前及化療3個周期后采用Nested-RT-PCR法檢測乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血hMAM mRNA陽性率的比較

乳腺癌患者化療前的外周血hMAMmRNA陽性率為54.02%（47/87），高于乳腺良性腫瘤患者的1.43%（1/70）和健康志愿者的0，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺良性腫瘤患者和健康志愿者的外周血hMAMmRNA陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 外周血hMAM mRNA陽性率與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系

乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA陽性率與患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型、雌激素受體和孕激素受體表達情況無關(guān)（P＞0.05），與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的hMAMmRNA陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05）。（表1）

2.3 乳腺癌患者化療前后外周血hMAM mRNA陽性率的比較

乳腺癌患者化療后的外周血hMAMmRNA陽性率為18.39%（16/87），低于化療前的54.02%（47/87），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.912，P＜0.05）；且化療前外周血hMAMmRNA表達陰性者，化療后無陽轉(zhuǎn)。

3 討論

乳腺癌原發(fā)于乳腺腺上皮組織，癌細胞之間連接松散，易脫落，具有早期轉(zhuǎn)移的特點，游離的癌細胞可隨血液轉(zhuǎn)移至全身，因此檢測癌細胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對乳腺癌臨床治療方案的選擇及預(yù)后判斷具有重要作用[8]。目前，乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位有腋窩淋巴結(jié)、骨髓、外周血，但常規(guī)檢測方法并不能檢測出微小轉(zhuǎn)移病灶。因此，選擇一種靈敏度及特異度較高的檢測指標對提高乳腺癌患者的臨床治療效果具有重要意義[9]。

表1 外周血hMAM mRNA陽性率與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系

研究表明，hMAM是第1個應(yīng)用差異篩選分離到的乳腺組織相關(guān)基因，位于11號染色體上，hMAM只表達于成人乳腺組織中，當乳腺組織發(fā)生癌變時，表達增多[10]。目前，有關(guān)hMAMmRNA表達與乳腺癌發(fā)病關(guān)系的研究較少。本研究采用Nested-RT-PCR檢測乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA表達情況，旨在探討hMAMmRNA表達與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系。RT-PCR是hMAM特異性檢測方法之一，能夠在多個細胞中篩選出一個癌細胞[11]。RT-PCR的原理：從可表達hMAM的組織或細胞中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在引物的作用下進行PCR擴增，將獲得的cDNA片段進行凝膠電泳分離[12-14]。Nested-RT-PCR是將RT-PCR產(chǎn)物作為模板，進行擴增，可增強反應(yīng)的特異性，提高檢測的準確性[15]。本研究結(jié)果表明，乳腺癌患者化療前的外周血hMAMmRNA陽性率為54.02%（47/87），高于乳腺良性腫瘤患者的1.43%（1/70）和健康志愿者的0，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺良性腫瘤患者和健康志愿者的外周血hMAMmRNA陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明hMAMmRNA在乳腺良性腫瘤患者及健康志愿者的外周血中低表達或不表達，而在乳腺癌患者中表達升高。本研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA陽性率與患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型、雌激素受體和孕激素受體表達情況無關(guān)（P＞0.05），與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的hMAMmRNA陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05）。說明乳腺癌的發(fā)病可能不受機體其他生理因素的影響，治療時應(yīng)控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而避免病情加重或術(shù)后復(fù)發(fā)。綜上所述，乳腺癌患者外周血hMAMmRNA的陽性表達與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，可為臨床診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。

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