長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

陳亮，喬紅梅，楊永宏，李芳琴

西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院腫瘤科，陜西寶雞7210060

乳腺癌是一種常見的危害女性身體健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，是導(dǎo)致女性死亡的主要原因。據(jù)報(bào)道，2015年新增乳腺癌病例約為23萬[1]，嚴(yán)重影響女性的身體健康和生命安全，因此加強(qiáng)對乳腺癌的診斷與治療是亟需解決的問題。目前，乳腺癌的治療手段主要有化療、放療、手術(shù)治療等。臨床研究表明，化療對乳腺癌的治療起著重要作用，對術(shù)前、術(shù)后乳腺癌患者實(shí)行化療，可有效提高乳腺癌的治療效果[2-3]。近年來，隨著藥理學(xué)的發(fā)展，一些藥物逐漸用于治療乳腺癌，但易產(chǎn)生耐藥性，增加了乳腺癌治療的難度，使其無法達(dá)到預(yù)期治療效果[4]。本研究探討了長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制，旨在為乳腺癌的治療提供新的思路與方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自美國模式菌種收集中心；長春瑞濱、依維莫司、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自南京碧云天生物技術(shù)有限公司；40只雄性裸鼠（體重15～20 g）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2009-0004；磷脂酰肌醇-3激酶（phospoinositide 3-kinase，PI3K）單克隆抗體、磷酸化PI3K（p-PI3K）單克隆抗體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（serine/threonine kinase 1，AKT1）單克隆抗體、磷酸化AKT1（p-AKT1）單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體均購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、CO2培養(yǎng)箱均購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；電泳槽購自美國Bio-rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購自法國Vilber Lourmat公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，加入10%胎牛血清和100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，次日更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代，在倒置顯微鏡中每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。

1.3 MTT檢測細(xì)胞的存活率

將長春瑞濱、依維莫司的濃度分別稀釋為5、10、20、40、60 μg/ml，分別計(jì)算依維莫司和長春瑞濱的半數(shù)抑制濃度（IC50），作為后續(xù)依維莫司組、長春瑞濱組及聯(lián)合組的藥物濃度。以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加入長春瑞濱、依維莫司處理細(xì)胞，以不加藥物處理的細(xì)胞為對照組，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 μl DMSO溶液，置于酶標(biāo)儀上檢測細(xì)胞在570 nm波長下的吸光值（OD值），取平均值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率

收集各組細(xì)胞，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）將細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×105/ml，加入 5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 裸鼠成瘤動物模型的制備

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用PBS進(jìn)行清洗，收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基與Matrigel膠按3∶1的比例混合重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/100 μl，取100 μl細(xì)胞懸液注射至裸鼠右側(cè)腹股溝處。飼養(yǎng)條件為20～25℃，自由進(jìn)食水。待腫瘤大小約為300 mm3時(shí)，隨機(jī)分為4組，每組10只，采用腹腔注射給藥法。對照組注射等量生理鹽水；長春瑞濱組按裸鼠體重計(jì)算給藥劑量，2 mg/kg，qd；依維莫司組按裸鼠體重計(jì)算給藥劑量，2 mg/kg，q3d；聯(lián)合組注射長春瑞濱（2 mg/kg，qd）+依維莫司（2 mg/kg，q3d）。4組小鼠均腹腔注射，連續(xù)注射15 d，測量腫瘤體積和重量。剝離腫瘤，稱取重量，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（A）及短徑（B），并按公式V=AB2/2計(jì)算腫瘤體積。

1.6 Western blot法檢測細(xì)胞中PI 3 K、p-PI 3 K、AKT 1、p-AKT 1蛋白的表達(dá)水平

胰酶消化并收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，使用不同濃度的藥物干預(yù)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)皿，冰上靜置，采用PBS清洗2次，加入80 μl細(xì)胞裂解液，混勻，吸出上清，根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min。配制相應(yīng)濃度的分離膠和濃縮膠，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。取10 μl蛋白樣品加入上樣孔，80 V電泳20 min后將電壓調(diào)整為120 V繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)，停止電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用封閉液室溫封閉2 h，加入適當(dāng)稀釋濃度的一抗，4℃孵育過夜，TBS/T清洗2次，每次10 min，加入適當(dāng)稀釋濃度的二抗，室溫孵育2 h，TBS/T清洗2次，每次10 min，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，顯影1～2 min，沖洗，晾干，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析相應(yīng)蛋白的灰度值，與GAPDH的比值為蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對細(xì)胞存活率的影響

隨著長春瑞濱或依維莫司藥物作用濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸下降，且呈一定的濃度依賴性（P＜0.01）。與對照組相比，5、10、20、40、60 μg/ml的長春瑞濱或依維莫司均可降低乳腺癌細(xì)胞的存活率。經(jīng)軟件分析，長春瑞濱和依維莫司作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞48 h的IC50濃度分別為21.92 μg/ml和30.46 μg/ml。長春瑞濱組、依維莫司組、聯(lián)合組的細(xì)胞存活率均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組的細(xì)胞存活率低于長春瑞濱組和依維莫司組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1～表3）

表1 不同濃度長春瑞濱對乳腺癌細(xì)胞存活率的影響（ n= 3，x-± s）

表2 不同濃度依維莫司對乳腺癌細(xì)胞存活率的影響（ n= 3，x-± s）

表3 長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對乳腺癌細(xì)胞存活率的影響（ n= 3，x-± s）

2.2 長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對細(xì)胞凋亡率的影響

長春瑞濱組、依維莫司組、聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率高于長春瑞濱組和依維莫司組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表4）

圖1 各組細(xì)胞的凋亡率

表4 長春瑞--濱聯(lián)合依維莫司對乳腺癌細(xì)胞凋亡率的影響（ n= 3，xx± s）

2.3 長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對腫瘤體積和重量的影響

長春瑞濱組、依維莫司組、聯(lián)合組的腫瘤體積和重量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組的腫瘤體積和重量均低于長春瑞濱組和依維莫司組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表5）

表5 長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對腫瘤體積和重量的影響（x-± s）

2.4 Western blot檢 測 細(xì) 胞 中PI 3 K、p-PI 3 K、AKT 1、p-AKT 1蛋白的表達(dá)水平

對照組、長春瑞濱組、依維莫司組、聯(lián)合組細(xì)胞的PI3K、AKT1蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；長春瑞濱組和聯(lián)合組細(xì)胞的p-PI3K、p-AKT1蛋白表達(dá)水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；長春瑞濱組細(xì)胞的p-PI3K、p-AKT1蛋白表達(dá)水平均低于依維莫司組，高于聯(lián)合組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、表6）

圖2 Western blot結(jié)果圖

表6 長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對細(xì)胞PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT AKT1蛋白相對表達(dá)水平的影響（n=3，，±s）

表6 長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對細(xì)胞PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT AKT1蛋白相對表達(dá)水平的影響（n=3，，±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與長春瑞濱組比較，P＜0.05

組別對照組長春瑞濱組依維莫司組聯(lián)合組F值P值0.528±0.069 0.578±0.055 0.525±0.061 0.531±0.078 0.430＞0.05 0.510±0.048 0.257±0.031a 0.614±0.062b 0.135±0.012a b 113.704＜0.01 0.942±0.068 0.955±0.058 0.948±0.062 0.962±0.075 0.052＞0.05 0.574±0.055 0.459±0.033a 0.668±0.052b 0.212±0.024a b 89.511＜0.01 PI3K p-PI3K AKT1p-AKT1

3 討論

乳腺癌多發(fā)于女性，發(fā)病率較高，且近年來呈年輕化趨勢。乳腺癌的產(chǎn)生主要是由于原位癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的黏附性降低，導(dǎo)致原位癌細(xì)胞易脫落至血液或淋巴液，從而危害患者的生命安全，臨床上表現(xiàn)為乳腺腫塊，皮膚改變，乳頭、乳暈異常等。乳腺癌的臨床癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，臨床上常采取手術(shù)結(jié)合化療的方式進(jìn)行治療，但部分患者易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重影響治療效果和預(yù)后。因此，研究新的化療藥物或方案成為目前乳腺癌研究的熱點(diǎn)之一。長春瑞濱可以與細(xì)胞有絲分裂的微管蛋白相結(jié)合，阻止雙微體聚合形成微管，能有效抑制癌細(xì)胞的有絲分裂，從而抑制癌細(xì)胞的生長[5]。研究表明，長春瑞濱對神經(jīng)的影響較小，具有安全、可靠的治療效果[6-7]。臨床研究表明，長春瑞濱對非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌具有高效的治療效果[8]。另有研究表明，長春瑞濱與曲妥珠單抗聯(lián)合治療乳腺癌具有較好的療效[9]。目前，哺乳動物中的雷帕霉素信號通路是研究的熱點(diǎn)之一，激活的雷帕霉素可促進(jìn)真核起始因子發(fā)生磷酸化，提高翻譯水平，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。依維莫司可有效抑制雷帕霉素的活性，具有抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[10]。本研究探討長春瑞濱聯(lián)合依維莫司對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、瘤體生長的影響。結(jié)果顯示，長春瑞濱、依維莫司均可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈一定的濃度依賴性。

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)常用于研究人類惡性腫瘤的基礎(chǔ)理論和臨床意義，裸鼠具有可穩(wěn)定生長、性能穩(wěn)定、易剝離等特點(diǎn)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)選取健康的裸鼠，將裸鼠右側(cè)腹股溝處作為腫瘤細(xì)胞的接種靶點(diǎn)。結(jié)果表明，長春瑞濱、依維莫司能夠在一定程度上有效抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7裸鼠種植瘤的生長。

PI3K是一種磷脂酰激酶，廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，受多種細(xì)胞因子受體的影響。PI3K可以磷酸化磷脂酰肌醇，從而發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用[13]。AKT是PI3K的下游靶基因，能被多種轉(zhuǎn)錄因子直接或間接磷酸化，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[14-15]?；罨腁KT可激活雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of repamycin，MTOR），調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、化療耐藥等過程，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[16-17]。依維莫司是MTOR抑制劑，研究表明，依維莫司可阻斷MTOR磷酸化，發(fā)揮抑制細(xì)胞周期和細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[18-20]。本實(shí)驗(yàn)中，依維莫司對乳腺癌細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1表達(dá)水平的影響不明顯，表明依維莫司對MTOR上游調(diào)控因子無明顯的調(diào)節(jié)作用。長春瑞濱對乳腺癌細(xì)胞中PI3K、AKT1的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的調(diào)節(jié)作用，但可促進(jìn)p-PI3K、p-AKT1表達(dá)下調(diào)。兩者聯(lián)合使用可進(jìn)一步降低p-PI3K和p-AKT1的表達(dá)水平，提示依維莫司有可能具有加強(qiáng)長春瑞濱抑制PI3K/AKT1信號通路的作用。

綜上所述，長春瑞濱和依維莫司主要通過調(diào)控PI3K/AKT1信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而有效抑制腫瘤生長，且聯(lián)合作用的效果更好。

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