靶向抑制TROP 2基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響研究

周童，張遠(yuǎn)鵬，張啟文

山東省萊蕪市人民醫(yī)院普外科，山東萊蕪2711000

胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有惡性程度高和預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。該病的發(fā)生、發(fā)展涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活等復(fù)雜過(guò)程，因此，從分子水平研究該病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對(duì)臨床治療有重要的意義[2]。腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)傳導(dǎo)因子 2（tumor-associated calcium signal transducer 2，TROP2）是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)的基因，是一種可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)分子[3]。在正常的組織中TROP2不表達(dá)或低表達(dá)，而在肺癌和食管癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等相關(guān)，因此TROP2可以作為一種預(yù)測(cè)癌癥預(yù)后的獨(dú)立因子[4-5]。有研究指出，在一些腫瘤細(xì)胞中，如大腸癌和乳腺癌等，抑制TROP2基因表達(dá)，可以降低癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[6-7]，然而TROP2基因在胰腺癌中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制胰腺癌細(xì)胞中TROP2基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞的增殖和凋亡情況，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為研究胰腺癌的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2016年6月至2017年7月山東省萊蕪市人民醫(yī)院保存的胰腺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織（距離腫瘤邊緣1～2 cm）各46例。所有患者的病歷資料完整且術(shù)前均未行化療和放療，所有組織均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，所有患者及家屬均對(duì)本研究知情同意。46例標(biāo)本所屬患者中，男24例，女22例；年齡為35～71歲，平均為（54.2±8.5）歲；組織病理學(xué)分級(jí)按照Kloppel標(biāo)準(zhǔn)分為高分化腺癌11例，中分化腺癌25例，低分化腺癌10例；臨床分期按照國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)（UICC）1992年標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。本研究經(jīng)山東省萊蕪市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 主要試劑與儀器

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胰酶、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，TROP2、cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，CCK8細(xì)胞增殖試劑盒、BCA試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1TROP 2基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)方法利用Trizol法提取胰腺癌和相應(yīng)的癌旁組織中的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Primer premier 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)基因TROP2及內(nèi)參基因GAPDH的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)TROP2和GAPDH基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：①TROP2引物序列，上游引物為5'-CCTCATCGCCGTCATCGT-3'，下游引物為5'-CGGTTCCTTTCTCAACTCCC-3'；②GAPDH引物序列，上游引物為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR的擴(kuò)增條件為：95℃下5 min；95 ℃下30 s；60 ℃下15 s，72 ℃下20 s，共40個(gè)循環(huán)。72℃延伸15 min，4℃保存。根據(jù)熒光定量PCR所得循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值，利用2-△△Ct法計(jì)算TROP2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染的方法人胰腺癌PANC-1細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h，將傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入 2 ml的 PANC-1細(xì)胞（濃度為 1×106/孔）。PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)融合度＞80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照美國(guó)Invitrogen公司Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染分為對(duì)照組（不經(jīng)任何處理）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA）和TROP2沉默組（轉(zhuǎn)染TROP2-siRNA）。

1.3.3 TROP 2、cleaved caspase 3、NOTCH 1、HES 1蛋白表達(dá)的檢測(cè)方法將對(duì)照組、陰性對(duì)照組和TROP2沉默組的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，加入RAPI細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞中的蛋白。取少量的蛋白樣品，利用BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。在蛋白樣品與上樣緩沖Buffer充分混勻后，煮沸變性10 min。取30 μg的變性蛋白，依次進(jìn)行SDSPAGE分離、PVDF轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂奶粉封閉，孵育TROP2、cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1作為一抗（均1∶1000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，TBST洗滌；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶1000稀釋?zhuān)?7℃孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，顯影，定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法將對(duì)照組、陰性對(duì)照組和TROP2沉默組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，以1×104/ml的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，收集細(xì)胞。每孔加入CCK8試劑10 μl，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，收集細(xì)胞。利用空白對(duì)照孔調(diào)零，選擇酶標(biāo)儀上450 nm處測(cè)定各孔的吸光度（A值），重復(fù)3次。細(xì)胞的增殖率=轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值×100%。

1.3.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取對(duì)照組、陰性對(duì)照組和TROP2沉默組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，再加入300 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×106/ml，取 100 μl的細(xì)胞懸液至流式管中，加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混勻后室溫避光孵育15 min，反應(yīng)管中再加入400 μl的PBS。1 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織中TROP 2基因mRNA表達(dá)

采用RT-PCR法檢測(cè)TROP2基因在胰腺癌組織和癌旁組織中的mRNA表達(dá)，TROP2基因在胰腺癌組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（5.987±0.583），明顯高于癌旁組織的（0.953±0.049），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1）

圖1 胰腺癌中TROP 2基因的mRNA表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA后PANC- 1細(xì)胞中TROP 2蛋白表達(dá)

TROP2-siRNA轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞48 h后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)對(duì)照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組TROP2蛋白表達(dá)，分別為（0.355±0.032）、（0.350±0.036）和（0.148±0.024），3組比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.342，P＜0.01）；TROP2-siRNA組TROP2蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而NC-siRNA組TROP2蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2）

圖2 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA后的PANC- 1細(xì)胞中TROP 2的蛋白表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA降低PANC- 1細(xì)胞增殖

對(duì)照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組細(xì)胞的平均存活率分別為（100±2.12）%、（98.88±3.23）%、（67.45±4.32）%，3組比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=91.484，P＜0.01）；TROP2-siRNA組細(xì)胞的存活率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而NC-siRNA組細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3）

圖3 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA對(duì)PANC- 1細(xì)胞增殖的影響

2.4 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA促進(jìn)PANC- 1細(xì)胞凋亡

對(duì)照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組細(xì)胞的凋亡率分別為（1.83±0.54）%、（1.85±0.51）%和（17.21±1.36）%，3組比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=295.137，P＜0.01）；TROP2-siRNA組細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而NC-siRNA組細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖4）

圖4 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA對(duì)PANC- 1細(xì)胞凋亡的影響

2.5 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA對(duì)PANC- 1細(xì)胞cleaved caspase 3、NOTCH 1、HES 1蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase 3和NOTCH1信號(hào)通路相關(guān)蛋白NOTCH1、HES1的表達(dá)，對(duì)照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組cleaved caspase 3蛋白表達(dá)分別為（0.03±0.01）、（0.03±0.01）和（0.13±0.02），NOTCH1的蛋白表達(dá)分別為（0.54±0.04）、（0.53±0.04）和（0.25±0.02），HES1的蛋白表達(dá)分別為（0.24±0.03）、（0.25±0.03）和（0.09±0.02），3組cleaved caspase 3、NOTCH1和HES1蛋白表達(dá)比較，差異均有明顯統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義（F=47.45、64.58、44.84，P＜ 0.01）；TROP2-siRNA組cleaved caspase 3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，NOTCH1、HES1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而NC-siRNA組cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖5）

圖5 轉(zhuǎn)染TROP 2-siRNA對(duì)PANC- 1細(xì)胞cleavedcaspa se 3、NOTCH 1、HES 1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

惡性腫瘤具有無(wú)限、快速的增殖能力，嚴(yán)重地威脅人類(lèi)的生命健康，其發(fā)生的原因包括抑癌基因、原癌基因和DNA損傷修復(fù)基因等表觀遺傳學(xué)的改變或突變。目前，多種腫瘤分子標(biāo)志物在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中的作用受到人們廣泛地關(guān)注[8-9]。TROP2屬于TACSTD家族，又稱(chēng)為EGP-1、TACSTD2、GA733-1，定位于人類(lèi)染色體1p32，是一種單次跨膜表面的糖蛋白。近年，研究者通過(guò)基因表達(dá)串聯(lián)分析、基因芯片和免疫組化等方法，發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中均有TROP2基因的高表達(dá)，其表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有密切的關(guān)系[10-13]。研究顯示，卵巢癌組織中TROP2基因高表達(dá)，其表達(dá)程度與腹腔積液轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及總生存期等有密切的關(guān)系[14-15]。宮頸癌組織中TROP2基因的高表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化程度及浸潤(rùn)深度等有密切的關(guān)系[16-17]。這些研究結(jié)果說(shuō)明，TROP2基因的高表達(dá)對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等有重要的影響；深入研究該基因在腫瘤中的生物學(xué)作用，尋找其作用機(jī)制，TROP2有望成為潛在的治療腫瘤的分子靶點(diǎn)。

研究顯示，抑制胃癌和前列腺癌組織中TROP2基因的表達(dá)，可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[18-19]；抑制肺腺癌組織中TROP2基因的表達(dá)，可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA介導(dǎo)的可以使基因在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，有高度的特異性和有效性，是研究基因功能的有效途徑[21-22]。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默胰腺癌組織中TROP2基因的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞的增殖和凋亡情況，結(jié)果顯示，抑制TROP2基因表達(dá)后細(xì)胞的增殖明顯降低，細(xì)胞凋亡增加。

細(xì)胞凋亡受到多種因素的調(diào)控，Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。caspase 3是Caspase家族中的關(guān)鍵酶和效應(yīng)蛋白，處在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，受到凋亡刺激后被激活，活化后可以使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[23]，目前已在胰腺癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞中得到證實(shí)[24-25]。NOTCH信號(hào)通路是一條進(jìn)化保守途徑，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和機(jī)體發(fā)育等的調(diào)節(jié)過(guò)程，由NOTCH受體及配體、下游效應(yīng)物、DNA結(jié)合蛋白組成，可以從多個(gè)方面對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡和機(jī)體發(fā)育等進(jìn)行調(diào)控，影響細(xì)胞命運(yùn)[26]。NOTCH1是其中的一個(gè)受體，其異常表達(dá)可以直接或間接地誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[27]。研究顯示，抑制胰腺癌和肺癌中NOTCH1信號(hào)通路，可以減緩腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[28-29]。HES1是NOTCH1信號(hào)通路下游最重要的靶基因，HES1基因表達(dá)與否是NOTCH1信號(hào)通路是否被激活的標(biāo)志[30]。本研究在抑制TROP2基因表達(dá)后檢測(cè)cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1蛋白表達(dá)，顯示抑制TROP2基因表達(dá)后cleaved caspase 3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，NOTCH1、HES1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。

綜上所述，抑制胰腺癌中TROP2基因的表達(dá)，可以阻斷NOTCH1信號(hào)通路，降低癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究為胰腺癌分子治療途徑的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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