HPV檢測技術(shù)在宮頸癌中的研究進展

李莉，陳汶，楊歡，朱琳

1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊830001

2國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院流行病學(xué)研究室，北京100021 3大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧大連116000

4新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院第三臨床醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊8300010

宮頸癌是全球范圍內(nèi)女性第二大常見的惡性腫瘤，每年約有52.8萬新發(fā)病例和27.5萬死亡病例，其中，87%的新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。中國每年約有9.9萬新發(fā)病例和3.1萬死亡病例[2]。Sttauss于1949年在電鏡疣體滲出液中發(fā)現(xiàn)了HPV顆粒[3]，Wolf等[4]于1975年提出了HPV感染與宮頸癌有關(guān)的假設(shè)。大量研究表明，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，高危型HPV感染是引起宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和子宮頸癌的主要因素[5-7]。

HPV檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于宮頸癌的篩查、流行病學(xué)調(diào)查及宮頸癌疫苗有效性的評價中[8-9]。目前，國內(nèi)外針對HPV的檢測方法層出不窮，HPV不同檢測方法的優(yōu)劣主要通過兩個方面進行評價：臨床使用價值（即臨床靈敏度）與檢測極限（即分析靈敏度）。臨床靈敏度（又稱功能靈敏度）是指在HPV檢測技術(shù)中試驗結(jié)果為陽性的患者所占的比例以及HPV對CIN2級及以上2的檢出能力；分析靈敏度（又稱檢測限量）是指可檢測的最低分析物濃度。良好的HPV檢測技術(shù)需要滿足較高的臨床靈敏度及較低的分析靈敏度。不同的研究目的需要采用不同的HPV檢測方法，本文就HPV檢測技術(shù)在宮頸癌相關(guān)研究中的應(yīng)用與特點作一簡要綜述。

1 HPV的病毒結(jié)構(gòu)和基因分型

1.1 HPV的病毒結(jié)構(gòu)

HPV屬于乳多空病毒科，是乳頭瘤屬的一類特異感染人皮膚和黏膜的雙鏈閉合環(huán)狀DNA病毒，是由DNA核心和蛋白衣殼組成的無包膜病毒。衣殼由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成?；蚪M按功能可分為3個編碼區(qū)：早期區(qū)（E）、晚期區(qū)（L）和長控制區(qū)（LCR）。

1.2 HPV的基因分型

目前已發(fā)現(xiàn)200多種HPV基因型別，其中，約54種HPV基因型別可感染生殖道黏膜，并且還有更多的HPV亞型正在鑒定中[10-11]。新的HPV基因型的判定標準是指該HPV基因型別在E6、E7或者L1區(qū)的核苷酸序列與其他任意已確定型別的HPV有超過10%的不同。根據(jù)其致病力及致病危險性的大小可將其分為高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV感染可引起宮頸、陰道、肛門、陰莖和口咽部位的上皮內(nèi)瘤變或癌變，其HPV型別主要包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82[12]。低危型HPV感染僅可引起生殖器疣等良性病變，其HPV型別主要包括6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81。與高危型HPV相比，低危型HPV的E6和E7蛋白干擾P53基因和pRb基因的作用相對較弱[13-14]。

2 HPV檢測技術(shù)

HPV病毒是不能夠被體外培養(yǎng)的，因此，目前針對HPV的檢測都是針對其病毒核酸進行的，從本質(zhì)上來說，HPV的檢測技術(shù)可以分為兩大類：靶標擴增技術(shù)和信號放大技術(shù)。下文將針對這兩種檢測技術(shù)進行詳細的介紹。

2.1 靶標擴增技術(shù)

2.1.1 通用引物聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerase chain reaction ，PCR）MY09/11是由Manos等設(shè)計的一對通用引物[15]，擴增HPV DNA中L1開放閱讀框架（L1 ORF）中的序列，片段長度為394～552 bp，一般在450 bp左右的位置上[16]，該對引物可擴增39種型別的HPV DNA，這39種型別包含了所有的高危型HPV以及可致病的低危型HPV。該方法操作簡便易行、價格低廉，但需要相對較大的PCR片段，特別是對于一些斷裂的、不易于擴增的DNA樣本如福爾馬林固定的標本和石蠟包埋的標本等，且該方法不能對HPV進行特異分型，也不適用于HPV多重感染[17]。GP5+/GP6+引物對對應(yīng)的產(chǎn)物長度為150 bp，可擴增20種型別的HPV（HPV 6、11、13、16、18、30、33、35、39、40、43、45、51、52、54、55、56、58、59、66）。GP5+/GP6+引物對的優(yōu)點在于對HPV的檢出靈敏度較高，包括一些低拷貝數(shù)的樣本，并且價格低廉，易于操作。但該引物對的缺點是不能用于HPV的特異分型，對于某些HPV型別如HPV44、68無法擴增[18]。有研究證實，使用MY09/11引物對和GP5+/GP6+引物對對HPV DNA實行嵌套PCR方案（nested multiplex PCR，NMPCR），較單用MY09/11引物對具有更高的敏感度和特異度[19-20]。SPF10引物對應(yīng)的產(chǎn)物長度為65 bp，該方法可檢測43種型別的HPV，并能同時對其中的25種型別進行具體分型（HPV6、11、16、18、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、66、68/73、70、74），該方法的缺陷是當(dāng)有多個HPV型別同時存在的時候，HPV各種型別存在競爭性抑制，在進行檢測的時候只能檢測出1種型別[21]。

2.1.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（fluorescent quantitativepolymerasechainreaction，F(xiàn)Q-PCR）該方法采用針對某個HPV基因型的特異引物及探針擴增病毒DNA序列。這種方法的靈敏度和特異度較高，可以進行病毒載量測定，也可以明確HPV的具體型別，不需要進行后續(xù)分析，但單通道檢測每個反應(yīng)只能檢測1種HPV型別，如需檢測多個型別，則要在不同的反應(yīng)體系中進行。Cobas 4800檢測便屬于此種方法，能同時檢測14種高危型HPV，包括針對HPV16、18內(nèi)參β-微球蛋白及其他 12種 HPV類型（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）的4種探針，因此能特異性分析HPV16及18的病毒載量，其他12種HPV類型則不能進行具體分型，并且該方法已于2014年通過美國食品藥品監(jiān)督管理總局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的認證。Cobas 4800的檢出限：HPV16的檢出限為300拷貝/ml，HPV18的檢出限為600拷貝/ml，其他型別的的檢出限為150拷貝/ml，Ct值為40。該方法的優(yōu)點：一次檢測可以在4個通道內(nèi)分別報告HPV16、18、其他高危型HPV與內(nèi)部質(zhì)控β-globin的結(jié)果[22-23]。

2.1.3 基于PCR的后續(xù)分析方法該方法的基本原理：HPV通用引物一般設(shè)置在HPV序列較為保守的位置，因此，先使用HPV通用引物進行PCR擴增，之后再對擴增產(chǎn)物進行后續(xù)分析即可確定HPV的基因型別，并且可以同時檢測多種HPV基因型。導(dǎo)流雜交法（HybriMax）是HPV基因型分型檢測的新方法，集導(dǎo)流雜交與基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢于一體，能同時對21種HPV基因（HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81）進行快速分型，且可判斷多重感染[24-25]。流氏熒光雜交技術(shù)亦稱為液相芯片技術(shù)，整個反應(yīng)過程都在混懸于液相中的微球表面上進行。針對于HPV病毒的L1區(qū)和L2區(qū)進行檢測，該方法可以檢出13種型別的HPV基因（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68），并能夠同時對其具體分型判斷多重感染。檢出限為250拷貝/ml，Ct值為 1000，其中，HPV39型的 Ct值為2000。該檢測方法為一種高通量的檢測技術(shù)，速度與固相雜交相比較快，但對設(shè)備的要求較高，花費也較大[26]。

2.1.4 mRNA擴增技術(shù)研究表明，高危型HPV的檢測也可以針對病毒的mRNA來進行，E6、E7癌蛋白分別與細胞內(nèi)p53和pRb結(jié)合，使p53和pRb基因失活是高危型HPV致癌的重要機制；靶向的HPV mRNA比靶向的HPV DNA能夠更加精確地甄別發(fā)病高風(fēng)險人群或?qū)m頸病變的進展[27-28]。Aptima（transcription mediated amplification，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)，即TMA技術(shù)）即針對于E6/E7的mRNA進行的，擁有Aptima HPV和Aptima 16、18/45兩種產(chǎn)品，于2011年獲得美國FDA的批準，是第1個獲FDA認證的HPV mRNA檢測技術(shù)，Aptima HPV可以檢出14種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68），但不能夠具體分型。Aptima16、18/45可以區(qū)分檢測HPV16型，對于18/45型的HPV感染僅能混合報告陽性或陰性，而無法區(qū)分具體的型別。該方法的檢出限為24～488拷貝/ml，S/CO值為0.5。研究表明該方法與HPV DNA檢測相比具有更好的靈敏度和特異度。由于Aptima不是采用宮頸脫落細胞內(nèi)的保守基因進行內(nèi)質(zhì)控的，因此，該方法的HPV檢測存在交叉反應(yīng)[29-30]。

2.2 信號放大技術(shù)

信號放大技術(shù)是指HPV檢測中HPV的DNA或RNA未被擴增，而是通過與HPV DNA結(jié)合的化學(xué)信號進行放大的方法，如Digene公司的HC2技術(shù)和care HPV技術(shù)以及Hologic公司的Cervista技術(shù)。HC2檢測方法是首個獲得美國FDA認證的HPV檢測方法，1999年被批準用于未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）分流，2003年又被批準用于30歲及以上的婦女聯(lián)合細胞學(xué)篩查。其應(yīng)用也獲得了歐洲CE以及中國FDA的認證，是一種采用免疫技術(shù)并通過化學(xué)發(fā)光使信號放大的檢測方法，該方法可以檢測13種HR-HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68）進行定性和半定量測定，但不具體區(qū)分型別。該方法的檢出限為1 pg/ml，相當(dāng)于5000拷貝/ml，HC2檢測最早獲得美國FDA批準且擁有良好的臨床敏感度和相對較好的特異度，因此該方法已成為各種HPV檢測技術(shù)的金標準，是其他HPV檢測方法的參照比較方法。但是，該方法不能夠?qū)PV具體分型，缺乏內(nèi)部質(zhì)控，且存在與低危型HPV（6、11、53、67、70、82等）的交叉反應(yīng)[29,31-32]。Care HPV是一種快速HPV-DNA檢測方法。主要原理為抗體結(jié)合順磁性磁珠技術(shù)，診斷結(jié)果用相對光單位（RLU）與最小陽性對照的RLU均值的比（RLU/CO）來表示。診斷陽性標準為標本中檢出的HPVDNA 1.0 pg/ml。截斷點為RLU/CO 1.0，≥1.0時認為HPV-DNA檢測陽性，＜1.0時為陰性。該技術(shù)可定量檢測14種高危HPV型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68），每次檢測樣本量可達80余份，檢測時間2.5 h[33]。與傳統(tǒng)的HPV檢測方法相比，該方法的優(yōu)點在于操作簡便易行，對取樣人員及實驗室條件要求較低，檢測時間較短。Cervista采用基于Invader專利技術(shù)的Cleavase酶切信號放大法檢測高危型HPV。在等溫反應(yīng)下，由Cleavase酶特異性識別并切割分子結(jié)構(gòu)，通過分子雜交和化學(xué)信號放大，從而直接檢測特定的HPV DNA序列。該產(chǎn)品擁有Cervista HPV HR和Cervista HPV 16/18兩種試劑，并于2009年獲得美國FDA批準，Cervista HPV HR批準的臨床應(yīng)用包括21歲及以上的ASCUS分流和30歲及以上的婦女聯(lián)合細胞學(xué)篩查。Cervista HPV 16/18臨床上被批準用于HPV陽性且細胞學(xué)陰性的分流轉(zhuǎn)診陰道鏡的管理。Cervista HPV HR可檢測14種HRHPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68），分別采用A7、A9和A5/A6三組探針，不能夠進行具體分型。Cervista的檢出限：HPV 16、18、31、45、52、56型為1250～2500拷貝/ml；HPV 33、39、51、58、59、66、68型為2500～5000拷貝/ml；HPV 35型為5000～7500拷貝/ml。靈敏度及特異度均較好，并擁有內(nèi)部質(zhì)控，但會與低危型HPV 67、70型產(chǎn)生交叉反應(yīng)[34-35]。

上述不同檢測方法的靈敏度與特異度比較如表1所示。

表1 不同HPV檢測方法的靈敏度及特異度的比較

3 小結(jié)與展望

宮頸癌是唯一可以通過有效的篩查和疫苗接種進行預(yù)防的惡性腫瘤。高危型HPV感染與宮頸癌發(fā)生之間的緊密關(guān)聯(lián)，使得HPV感染用于宮頸癌的篩查越來越普遍，一些地區(qū)采用HPV感染來分流細胞學(xué)意義不明確的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）人群，也有一些醫(yī)院采用HPV是否感染來評價婦女宮頸CIN的治療效果，單獨采用HPV檢測或?qū)PV檢測與細胞學(xué)相結(jié)合用于宮頸癌的篩查。隨著分子診斷技術(shù)的不斷進步，HPV基因檢測方法將會不斷被完善，鑒于中國宮頸癌的疾病負擔(dān)與篩查現(xiàn)狀，未來需要一種更易普及、成本更低、操作更簡便的HPV檢測技術(shù)。在實際的工作中，也應(yīng)該結(jié)合具體的情況，選擇最適合的HPV檢測技術(shù)，最有效地降低女性宮頸癌的發(fā)病率。

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-386.

[2]Li J,Kang LN,Qiao YL.Review of the cervical cancer disease burden in mainland China[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(5):1149-1153.

[3]毛靜月.焦磷酸測序技術(shù)在高危型HPV分型中應(yīng)用的研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2008.

[4]Wolf H,Zur Hausen H,Klein G,et al.Attempts to detect virus-specific DNA sequences in human tumors.III.Epstein-Barr viral DNA in non-lymphoid nasopharyngeal carcinoma cells[J].Med Microbiol Immunol,1975,161(1):15-21.

[5]Walboomers JM,Jacobs MV,Manos MM,et al.Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J].J Pathol,1999,189(1):12-19.

[6]Eiben GL,da Silva DM,Fausch SC,et al.Cervical cancer vaccines:recent advances in HPV research[J].Viral Immunol,2003,16(2):111-121.

[7]Mu?oz N,Bosch FX,de Sanjosé S,et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer[J].N Engl J Med,2003,348(6):518-527.

[8]Luhn P,Wentzensen N.HPV-based tests for cervical cancer screening and management of cervical disease[J].Curr Obstet Gynecol Rep,2013,2(2):76-85.

[9]Wheeler CM,Hunt WC,Joste NE,et al.Human papillomavirus genotype distributions:implications for vaccination and cancer screening in the United States[J].J Natl Cancer Inst,2009,101(7):475-487.

[10]Doorbar J,Quint W,Banks L,et al.The biology and lifecycle of human papillomaviruses[J].Vaccine,2012,30(Suppl 5):F55-F70.

[11]Vinodhini K,Shanmughapriya S,Das BC,et al.Prevalence and risk factors of HPV infection among women from various provinces of the world[J].Arch Gynecol Obstet,2012,285(3):771-777.

[12]Cubie HA.Diseases associated with human papillomavirus infection[J].Virology,2013,445(1-2):21-34.

[13]Werness BA,Levine AJ,Howley PM.Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53[J].Science,1990,248(4951):76.

[14]Gage JR,Meyers C,Wettstein FO.The E7 proteins of the nononcogenic human papillomavirus type 6b(HPV-6b)and of the oncogenic HPV-16 differ in retinoblastoma protein binding and other properties[J].J Virol,1990,64(2):723-730.

[15]Jorge GPNR,Caldeira Martins TM.Human papillomavirus detection kit and assay:Japan,PT2009/000015[P].2009-09-24.

[16]Kleter B,van Doorn LJ,Schrauwen L,et al.Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus[J].J Clin Microbiol,1999,37(8):2508-2517.

[17]Baleriola C,Millar D,Melki J,et al.Comparison of a novel HPV test with the Hybrid CaptureⅡ (hcⅡ)and a reference PCR method shows high specificity and positive predictive value for 13 high-risk human papillomavirus infections[J].J Clin Virol,2008,42(1):22-26.

[18]Tsiodras S,Georgoulakis J,Chranioti A,et al.Hybrid capture vs.PCR screening of cervical human papilloma virus infections.Cytological and histological associations in 1270 women[J].BMC Cancer,2010,10:53.

[19]Sotlar K,Diemer D,Dethleffs A,et al.Detection and typing of human papillomavirus by e6 nested multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2004,42(7):3176-3184.

[20]馬卿蓮,肖長義,李志英,等.HPV L1 C-末端保守序列多肽抗血清對臨床標本中不同型別HPV的檢測[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,43(3):324-327;335.

[21]Castle PE,Porras C,Quint WG,et al.Comparison of two PCR-based human papillomavirus genotyping methods[J].J Clin Microbiol,2008,46(10):3437-3445.

[22]陳汶,于露露,王紅,等.Cobas 4800高危型人乳頭瘤病毒檢測技術(shù)在子宮頸癌前病變篩查和細胞學(xué)轉(zhuǎn)診中的應(yīng)用[J].中華腫瘤雜志,2012,34(7):543-548.

[23]Jun SY,Park ES,Kim J,et al.Comparison of the cobas 4800 hpv and hpv 9g dna chip tests for detection of highrisk human papillomavirus in cervical specimens of women with consecutive positive hpv tests but negative pap smears[J].PLoS One,2015,10(10):e0140336.

[24]陶萍萍,卞美璐,歐華,等.導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在人乳頭狀瘤病毒檢測中應(yīng)用的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2006,41(1):43-47.

[25]Tao P,Zheng W,Wang Y,et al.Sensitive HPV genotyping based on the flow-through hybridization and gene chip[J].J Biomed Biotechnol,2012,2012:938780.

[26]Ozaki S,Kato K,Abe Y,et al.Analytical performance of newly developed multiplex human papillomavirus genotyping assay using Luminex xMAP?technology(Mebgen?HPV Kit)[J].J Virol Methods,2014,204:73-80.

[27]Sotlar K,Stubner A,Diemer D,et al.Detection of highrisk human papillomavirus E6 and E7 oncogene transcripts in cervical scrapes by nested RT-polymerase chain reaction[J].J Med Virol,2004,74(1):107-116.

[28]Alaghehbandan R,Fontaine D,Bentley J,et al.Performance of ProEx C and pretect HPV-Proofer E6/E7 mRNA tests in comparison with the hybrid capture 2 HPV DNA test for triaging ASCUS and LSIL cytology[J].Diagn Cytopathol,2013,41(9):767-775.

[29]Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al.Aptima HPV E6/E7 mRNA test is as sensitive as Hybrid Capture 2 Assay but more specific at detecting cervical precancer and cancer[J].J Clin Microbiol,2011,49(2):557-564.

[30]Huijsmans CJ,Geurts-Giele WR,Leeijen C,et al.HPV Prevalence in the Dutch cervical cancer screening population(DuSC study):HPV testing using automated HC2,cobas and Aptima workflows[J].Bmc Cancer,2016,16(1):922.

[31]吳文湘,劉朝暉.62種人乳頭瘤病毒臨床檢測技術(shù)點評[J].中國計劃生育和婦產(chǎn)科,2016,8(9):1-3.

[32]Clavel C,Masure M,Bory JP,et al.Hybrid Capture II-based human papillomavirus detection,a sensitive test to detect in routine high-grade cervical lesions:a preliminary study on 1518 women[J].Br J Cancer,1999,80(9):1306-1311.

[33]方婧,洪穎.高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒-Care HPV用于宮頸癌及癌前病變篩查的臨床價值[J].中國婦幼健康研究,2016,27(4):457-459.

[34]楊二姣,潘琪,江虹,等.兩種高危型HPV檢測技術(shù)診斷宮頸病變的臨床價值比較[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2015,15(4):653-655;695.

[35]勞小斌,孫爾維,全樹綠,等.多色熒光PCR技術(shù)與酶切信號放大法檢測人乳頭瘤病毒的比較[J].中國婦幼保健,2015,30(10):1617-1620.

[36]Depuydt CE,Boulet GA,Horvath CA,et al.Comparison of MY09/11 consensus PCR and type-specific PCRs in the detection of oncogenic HPV types[J].J Cell Mol Med,2007,11(4):881-891.

[37]Lloveras B,Gomez S,Alameda F,et al.HPV testing by cobas HPV test in a population from Catalonia[J].PLoS One,2013,8(3):e58153.

[38]薛白.導(dǎo)流雜交HPV檢測在宮頸病變篩查中的價值[D].大連:大連醫(yī)科大學(xué),2016.

[39]Ying H,Jing F,Fanghui Z,et al.High-risk HPV nucleic acid detection kit-the careHPV test-a new detection method for screening[J].Sci Rep,2014,4(4):4704.

[40]Tuerxun G,Yukesaier A,Lu L,et al.Evaluation of care HPV,cervista human papillomavirus,and hybrid capture 2 methods in diagnosing cervical intraepithelial neoplasia grade 2+in xinjiang uyghur women[J].Oncologist,2016,21(7):825-831.