乙醇法提取金銀花總黃酮工藝研究

張君　 朱金艷　祝軍

摘 要：黃酮類化合物是金銀花中含量較多的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)功效，以乙醇為溶劑，對(duì)提取工藝進(jìn)行研究，結(jié)果表明：乙醇含量為70%、固液比1∶19、65℃下浸提3小時(shí)為最佳提取條件，樣品提取率為3.55%。結(jié)果證明采用乙醇提取金銀花黃酮是比較有效的途徑，且方法操作簡(jiǎn)單便于推廣和普及。

關(guān)鍵詞：乙醇；提?。唤疸y花；總黃酮

黃酮類化合物是天然產(chǎn)物，主要存在于植物中，許多藥材的有效成分均為黃酮?？傸S酮可以改善人體的血液循環(huán)，降低人體膽固醇含量，降低心腦血管疾病的發(fā)生。它還是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的自由基，可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生，其藥理作用以引起重視。隨著社會(huì)進(jìn)步和對(duì)健康的追求，研究總黃酮類物質(zhì)取得了一定進(jìn)步，通過進(jìn)一步研究，可以發(fā)揮其更大的作用，創(chuàng)造更多的機(jī)遇，使其在諸多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

本試驗(yàn)采用乙醇法來提取總黃酮類物質(zhì)，并通過總黃酮類物質(zhì)的定性鑒定（顏色反應(yīng)），確定有機(jī)溶劑提取液含有黃酮類物質(zhì)。再利用單因素通過了不同的提取溫度、乙醇濃度、時(shí)間、液固比等條件對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)乙醇法提取金銀花中黃酮類物質(zhì)的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)金銀花總黃酮提供理論依據(jù)，以達(dá)到更加充分、合理的利用金銀花資源提高金銀花附加值的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料 市售金銀花。

1.1.2 試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品；90%乙醇、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鋅粉、硼酸等均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AL204-IC電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮的提取工藝流程 金銀花→烘干→粉碎篩選→配制溶液→恒溫提取→離心分離→蒸發(fā)濃縮。

1.2.2 金銀花總黃酮含量測(cè)定 （1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取11.2毫克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用90%乙醇溶解，定容至50毫升容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4毫升，搖勻；放置60分鐘后加入4%氫氧化鈉溶液4毫升，搖勻；最后用60%的乙醇定容，15分鐘后與420納米處測(cè)定吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）制作金銀花總黃酮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10.0毫升蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50毫升比色管中，加入亞硝酸鈉溶液（5%）2毫升，搖勻，并靜置7分鐘，再加入硝酸鋁溶液（5%）2毫升，搖勻，再靜置7分鐘，加入氫氧化鈉溶液（10%）5毫升，以無(wú)水乙醇定容至刻度，混勻，靜置20分鐘。以空白試劑為零點(diǎn)，在420nm波長(zhǎng)的范圍內(nèi)測(cè)定吸光度。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00毫升分別置于25毫升比色管中，按照上述步驟顯色，以空白調(diào)零點(diǎn)，在420納米處測(cè)定吸光度。

1.2.3 金銀花總黃酮的定性鑒定 量取金銀花黃酮提取液80毫升于蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至8毫升，備用。（1）鹽酸—鋅粉反應(yīng)。取2毫升樣品置于試管中，加少量鋅粉，搖勻后，滴加數(shù)滴鹽酸，當(dāng)溶液呈粉紅色時(shí)證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。（2）硼酸反應(yīng)。取2毫升樣品濃縮液放于試管內(nèi)，加入少許5%硼酸溶液，搖晃，當(dāng)溶液無(wú)反應(yīng)時(shí)證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。（3）氫氧化鈉反應(yīng)。取2毫升樣品濃縮液放于試管內(nèi)，加入少許氫氧化鈉，搖晃，當(dāng)溶液呈黃色時(shí)證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。（4）濃硫酸反應(yīng)。取2毫升樣品濃縮液放于試管內(nèi)，加入少許濃硫酸，搖晃，當(dāng)溶液呈橙紅色時(shí)證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。

1.2.4 單因素試驗(yàn) （1）固液比對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，分別按1∶15、1∶17、1∶19、1∶21、1∶23的固液比加入70%的乙醇中，于65℃回流3小時(shí)。相同條件提取兩次，然后將兩次濾液合并，蒸發(fā)濃縮至100毫升，測(cè)定并計(jì)算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)三次取平均值。（2）溫度對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以70%乙醇為提取劑，固液比為1∶19，分別在55、60、65、70、75℃回流3小時(shí)。常溫放置冷卻后過濾，濾渣于相同條件下重復(fù)提取1次，然后將兩次濾液合并，蒸發(fā)濃縮至100毫升，測(cè)定并計(jì)算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)3次取平均值。（3）時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以70%乙醇為提取劑，固液比為1∶19，在65℃分別回流1、2、3、4、5小時(shí)。相同條件提取兩次，然后將兩次濾液合并，蒸發(fā)濃縮至100毫升，測(cè)定并計(jì)算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)3次取平均值。（4）乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響。精精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以固液比為1∶19，在65℃分別分別放于乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%回流3小時(shí)，放置冷卻后過濾，濾渣在此條件下重復(fù)提取1次，然后將兩次濾液合并，蒸濃縮至100毫升，測(cè)定并計(jì)算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 正交試驗(yàn)提取工藝優(yōu)化 在乙醇法提取金銀花黃酮過程中，對(duì)液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度等影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.2.6 金銀花總黃酮的測(cè)定及含量計(jì)算 準(zhǔn)確稱取10毫升的金銀花有機(jī)提取液置于50毫升容量瓶中，按蘆丁顯色標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定金銀花提取液在420納米處測(cè)定吸光度，計(jì)算金銀花提取物中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（見圖1），得回歸方程：Y=10.88X+0.0073，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。結(jié)果表明，總黃酮含量在該范圍內(nèi)與吸光度線性良好。

2.2 金銀花總黃酮的顏色反應(yīng)

依據(jù)總黃酮的定性鑒定方法，含有黃酮類的物質(zhì)在與鹽酸—鋅粉、硼酸溶液、氫氧化鈉溶液、濃硫酸中反應(yīng)，應(yīng)分別顯粉紅色、無(wú)反應(yīng)、黃色、橙紅色（表1）。本試驗(yàn)金銀花提取液的顏色反應(yīng)結(jié)果與定性鑒定的顏色反應(yīng)結(jié)果一致，確認(rèn)金銀花—乙醇的濃縮提取液中含有黃酮類物質(zhì)。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)金銀花總黃酮含量影響程度不同。

2.3.1 固液比對(duì)金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析 由表2可知，固液比對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響，當(dāng)用70%乙醇為有機(jī)溶劑提取金銀花總黃酮時(shí)：隨著固液比的增加，金銀花中總黃酮的提取率先增加后下降，當(dāng)固液比在1∶19時(shí)，金銀花中總黃酮的提取率最佳，所以在該試驗(yàn)條件下固液比1∶19最為合適。

2.3.2 溫度對(duì)金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響如表3，在該試驗(yàn)條件下溫度對(duì)金銀花總黃酮的提取率先增加后減少，在65℃時(shí)金銀花中總黃酮的提取率最高。

2.3.3 時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析 其他條件不變的情況下，提取時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響結(jié)果見表4，提取時(shí)間在0～3小時(shí)時(shí)提取液中總黃酮類物質(zhì)的濃度隨時(shí)間增加而升高，在3小時(shí)時(shí)達(dá)到最高，即使增加時(shí)間濃度也不會(huì)提高，所以3小時(shí)是最佳的提取時(shí)間。

2.3.4 乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析 乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮提取率的結(jié)果如表5，體積分?jǐn)?shù)在70%之內(nèi)隨分?jǐn)?shù)增加而增加，在70%達(dá)到最大濃度3.55%，體積分?jǐn)?shù)超過70%以后即使增加濃度提取率也不會(huì)增加，所以在該試驗(yàn)條件下70%乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳體積分?jǐn)?shù)。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

本試驗(yàn)對(duì)液固比A、乙醇濃度B、時(shí)間C、溫度D均不同的正交試驗(yàn)，見表6和表7。

由表7正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各種因素對(duì)金銀花總黃酮含量提取率影響程度依次為A>B>C>D。依實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，溶劑越多，提取率越高，但由于結(jié)果相近，越多的溶劑會(huì)造成資源的大量浪費(fèi)。提取時(shí)間對(duì)提取率也有一定的影響，時(shí)間過短提取不充分，時(shí)間過長(zhǎng)使得提取周期延長(zhǎng)，而且長(zhǎng)期處于高溫狀態(tài)可能造成黃酮被高溫破壞，反而降低黃酮的提取率。所以由表分析結(jié)果中數(shù)據(jù)4種因素水平在A2、B2、C3、D1組合時(shí)為最佳提取條件，在該條件下提取液中黃酮含量最高，黃酮含量達(dá)到3.55%。

3 結(jié)論與討論

用乙醇提取金銀花總黃酮最佳提取條件為，固液比1∶19，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間為3小時(shí)，提取溫度為65℃，在該工藝條件下金銀花黃酮含量為3.55%。在這些條件下，該有機(jī)溶劑提取工藝最優(yōu)化，費(fèi)用最低，提取溶劑使用量最少，提取物易收集，無(wú)污染，可實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，是提取金銀花總黃酮的一種非常有效的方法。

目前對(duì)黃酮提取的研究基本技術(shù)有3種：水提法；溶劑提取法；超聲波輔助法。如何將幾種簡(jiǎn)單的方法配合使用獲得更高的提取率是未來金銀花黃酮類物質(zhì)提取的研究方向。