應(yīng)用表面活性劑提取玉竹黃酮的工藝研究

夏光輝，梁鈺，韓爽

（1.通化師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林通化134002；2.通化師范學(xué)院生物制劑國際合作研究中心，吉林通化134002）

玉竹[學(xué)名 Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]，別名甜草根、地管子，屬于百合科黃精屬植物[1]。玉竹根莖是藥食兩用材料，含有多糖、黃酮、生物堿、皂苷等成分[2]，具有除煩、止渴的功效[3]，可治熱病傷陰、咳嗽、消谷易虛、勞發(fā)熱饑等癥[4-5]。近幾年，玉竹作為一種具有獨特的保健與營養(yǎng)功能的食材受到人們的廣泛關(guān)注。黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一類天然色素[6]，是玉竹的重要活性成分。玉竹中的黃酮主要高異黃酮類[7]，具有清除自由基、抗病毒、抑菌、防治心血管疾病等生理功能[8-9]。研究黃酮的生物學(xué)活性，必須采取合適的方法對黃酮成分進行提取，天然環(huán)保、無殘留的提取方法廣受關(guān)注。目前，提取黃酮的方法主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶法提取等[10-11]，各有優(yōu)缺點，但共性問題是環(huán)保程度偏低，提取成本偏高[12]。采用表面活性劑來提取玉竹黃酮的研究尚未有報道。表面活性劑是一類可降低溶液表面張力，具有親水與疏水雙重基團的特殊試劑，具有較強的增溶作用[13-14]。提取液可不經(jīng)處理，直接采用大孔樹脂來富集黃酮成分，省去有機溶劑提取時的濃縮、冷凝等操作，節(jié)省提取成本，提取后的殘余原料經(jīng)水洗后還可加工利用。常用的聚乙二醇系列和吐溫系列表面活性劑無毒或毒性較低，價格低廉，在樣品中無殘留，對環(huán)境無污染，對黃酮類成分具有較好的溶解性。以表面活性劑代替有機溶劑提取玉竹黃酮，能降低提取成本，減小環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原材料與試劑

玉竹：產(chǎn)于吉林省白山市松江河鎮(zhèn)的新鮮玉竹；聚乙二醇400：沈陽華東試劑廠；吐溫80：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；烷基糖苷、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、平平加：廣州市陽航化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海士鋒生物科技有限公司；D101大孔樹脂：天津市光復(fù)精細化工研究所；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：均為分析純。

1.1.2 試驗設(shè)備

BNI-A電子天平稱：臺灣巨林櫻花企業(yè)；HWS26恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮升生化儀器廠；TDL-5-A離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHD-Z（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；T6-紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE-130藥物粉碎機：上海華巖儀器設(shè)備有限公司。

1.2 表面活性劑提取玉竹黃酮的工藝操作方法

1.2.1 表面活性劑提取玉竹黃酮的工藝流程

玉竹根莖→水洗→烘干→粉碎→稱量→表面活性劑溶液提取黃酮→離心→過濾→濾渣二次提取→離心→抽濾→合并提取液→過大孔樹脂柱→水洗→80%醇洗→玉竹黃酮粗提液

1.2.2 操作方法

將玉竹根莖清洗干凈，烘干之后用藥物粉碎機粉碎，過40目篩，得到玉竹粉末。稱取1 000 g玉竹粉末，置入玻璃罐中，加入一定質(zhì)量分數(shù)的表面活性劑水溶液后放入超聲波提取機中，攪拌均勻，于試驗設(shè)定溫度下提取一定時間后于5 000 r/min下離心5min，抽濾，得到的殘渣再次加入相同質(zhì)量分數(shù)的表面活性劑水溶液，在相同條件下二次提取。合并兩次提取的濾液。濾液以1mL/min的速度泵入D101大孔樹脂柱，全部過柱后，用5倍～10倍柱體積的蒸餾水洗滌，再用2倍柱體積的80%乙醇溶液洗滌，收集80%乙醇洗液，即為玉竹黃酮粗提液。

1.3 表面活性劑提取玉竹黃酮的試驗方法

1.3.1 適宜表面活性劑種類的確定

對吐溫80、聚乙二醇400、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、烷基糖苷、平平加等分別進行單一種類、兩種和3種復(fù)配使用來提取玉竹黃酮，操作時表面活性劑的濃度為 2%，料液比為 1 ∶10（g/mL），超聲提取 20min，提取2次。計算在不同種類表面活性劑下的玉竹黃酮提取率，分析確定最佳表面活性劑種類。

1.3.2 其他單因素試驗

分別進行表面活性劑濃度、適宜料液比、提取時間、提取溫度4個方面的單因素試驗。選取的表面活性劑濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），提取溫度為 20、25、30、35、40、45 ℃，提取時間為 5、10、15、20、25、30min。

1.3.3 表面活性劑提取玉竹黃酮的正交試驗設(shè)計

確定表面活性劑種類后，以料液比、提取劑濃度、提取溫度和提取時間為因素，參考單因素試驗最佳結(jié)果，各因素各取3個水平，進行正交試驗以確定各因素的最佳組合方式。

1.3.4 玉竹黃酮粗提液中黃酮含量檢測方法

參考溫玲蓉等[15]采用硝酸鋁顯色法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為y=1.052 6x-0.005 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，線性關(guān)系良好。對玉竹黃酮樣品采用硝酸鋁顯色法測定吸光度后，由回歸方程計算樣品溶液中黃酮的含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑提取玉竹黃酮單因素試驗

2.1.1 表面活性劑種類的確定

對不同種類的表面活性劑分別進行玉竹黃酮提取試驗，試驗結(jié)果見表1。

續(xù)表1 不同類型表面活性劑提取玉竹黃酮的提取率Continue table1 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidsw ith different kindsofsurfactants

由表1可知，聚乙二醇400對玉竹黃酮的提取率最大，幾種表面活性劑配合使用沒有提高玉竹黃酮的提取率。不同種類的表面活性劑由于其在水中形成的膠束結(jié)構(gòu)的差異[16]，對黃酮的溶解能力是不同的。試驗數(shù)據(jù)表明，聚乙二醇400對玉竹黃酮的溶解能力高于其他種類的表面活性劑。為考察幾種表面活性劑復(fù)配使用對玉竹黃酮提取率的影響情況，設(shè)計了兩種、三種表面活性劑的不同比例復(fù)配使用方案，研究結(jié)果表明，幾種表面活性劑的復(fù)配使用對玉竹黃酮的提取率無影響，效果不比單一種類的好。選擇單一種類的提取劑，不但操作簡單，而且成本更低，對玉竹黃酮的提取效果更佳。確定聚乙二醇400為提取玉竹黃酮的最佳試劑。

2.1.2 提取劑濃度的確定

聚乙二醇400質(zhì)量分數(shù)對玉竹黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 聚乙二醇400質(zhì)量分數(shù)對玉竹黃酮提取率的影響Fig.1 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidsw ith differentmass fraction of polyethyleneglycol400

由圖1可知，聚乙二醇400的質(zhì)量分數(shù)為2%～6%時，玉竹黃酮的提取率隨聚乙二醇400濃度的升高而提高。質(zhì)量分數(shù)大于6%后，玉竹黃酮提取率開始緩慢減小，說明再增大聚乙二醇400的濃度已無意義。當(dāng)聚乙二醇400濃度達到10%時，溶液黏度明顯上升，不利于玉竹黃酮的溶解和后續(xù)黃酮富集過程的進行。確定合適的聚乙二醇400提取劑濃度為6%。

2.1.3 適宜料液比的確定

料液比對玉竹黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對玉竹黃酮提取率的影響Fig.2 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidswith differentsolid-liquid ratio of surfactants

如圖 2 所示，料液比從 1 ∶5（g/mL）到 1 ∶15（g/mL）之間，玉竹黃酮的提取率隨料液比的增大而升高；料液比超過1∶15（g/mL）后，玉竹黃酮的提取率增加幅度較小。增加提取劑用量，隨可小幅度提高玉竹黃酮的提取率，但提取劑聚乙二醇400的用量卻顯著增加，增加了提取成本。同時，提取劑用量越大，后續(xù)用大孔樹脂富集玉竹黃酮的時間越長，延長了提取工藝的總時間?？梢姡x取適宜的料液比會提高玉竹黃酮提取操作過程的經(jīng)濟效益。料液比為1∶15（g/mL）時提取率較高，同時最省提取溶劑，經(jīng)濟性最強。

2.1.4 適宜提取溫度的確定

提取溫度對玉竹黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對玉竹黃酮提取率的影響Fig.3 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidswith differentextraction tem perature

在對玉竹黃酮進行提取時，采用了超聲波進行輔助。頻率高于20 kHz的超聲波可加速物質(zhì)分子的振動，增強傳遞性能，加速可溶成分的擴散和傳播[17]。超聲波還可破壞植物細胞壁，促進細胞內(nèi)容物的溶出。同時，超聲波還可產(chǎn)生一定程度的熱效應(yīng)。采用超聲波輔助提取，可顯著縮短提取時間。從圖3可以看出，采用30℃的提取溫度可以達到較高的提取率，再提高溫度，會導(dǎo)致和玉竹黃酮極性相近的雜質(zhì)快速溶出，對后續(xù)操作不利，導(dǎo)致玉竹黃酮的提取率逐漸小幅下降。30℃的提取溫度接近室溫，對黃酮成分的穩(wěn)定性影響很小，而且提取時容易操作，可利用超聲波自身的產(chǎn)熱效應(yīng)就可達到，不需要額外加熱。確定適宜的提取溫度為30℃。

2.1.5 適宜提取時間的確定

提取時間對玉竹黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對玉竹黃酮提取率的影響Fig.4 The influenceof extraction rateof Polygonatum odoratum flavonoidsw ith differentextraction tim e

由圖4可以看出，5min～20min內(nèi)，隨著表面活性劑提取玉竹黃酮時間的延長，玉竹黃酮的提取率逐漸增大；超過20min后，玉竹黃酮的提取率開始減小，可能原因是超聲波導(dǎo)致部分黃酮與雜質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或?qū)е虏糠贮S酮分子發(fā)生水解，致使提取率下降。適當(dāng)延長提取時間，有助于黃酮與聚乙二醇400水溶液的充分接觸，但當(dāng)提取時間越長，超聲波耗費的能量越多，成本會隨之增大。選取20min的超聲提取時間比較適宜，在此范圍內(nèi)，玉竹黃酮的提取率已達最高，超聲波導(dǎo)致的提取液溫度升高幅度較小，可容易調(diào)控。

2.2 表面活性劑提取玉竹黃酮正交試驗結(jié)果

經(jīng)單因素試驗確定聚乙二醇400為提取玉竹黃酮的最佳試劑，以料液比、提取劑濃度、提取溫度和提取時間為因素進行的L9（34）正交試驗設(shè)計見表2，試驗結(jié)果見表3。

由表3可以看出，3號試驗的提取率最高，但未必是最佳提取方式組合。對正交試驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析可知，影響玉竹黃酮提取率的因素大小為B＞C＞D＞A，即聚乙二醇400濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比。最佳提取方式組合為 A1B3C2D2，即料液比為 1∶10（g/mL），聚乙二醇400質(zhì)量分數(shù)為8%，提取溫度為30℃，提取時間為20min。按照A1B3C2D2條件進行3次平行試驗，玉竹黃酮平均提取率為0.662 7%，高于正交試驗的最高水平。

表2 玉竹黃酮提取工藝正交試驗設(shè)計Tab le2 Theorthogonalexperiment design of Polygonatum odoratum flavonoidsextraction p rocess

表3 表面活性劑法提取玉竹黃酮正交試驗結(jié)果Tab le3 Theorthogonalexperiment resu ltsof Polygonatum odoratum flavonoidsextraction ratewith surfactants

3 結(jié)論

以聚乙二醇400為最適提取劑，對玉竹黃酮的提取工藝進行了研究。通過單因素和正交試驗，確定了表面活性劑提取玉竹黃酮的最佳工藝參數(shù)。最佳操作條件為，聚乙二醇400提取劑的濃度為8%，料液比為1∶10（g/mL），提取溫度為 30 ℃，提取時間為 20min，在此條件下玉竹黃酮的提取率可達0.662 7%。使用表面活性劑來提取玉竹黃酮具有成本低、無污染、綠色節(jié)能等特點，為更好地研究玉竹黃酮特性和開發(fā)玉竹功能食品提供理論參考。

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