超聲波處理對(duì)花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響

張文，張麗芬，陳復(fù)生，王培

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

花生是全球四大油料作物之一，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和貿(mào)易中占有重要地位?；ㄉ械鞍缀繛?5%～35%，是植物蛋白質(zhì)的第三大重要來(lái)源，占世界蛋白質(zhì)供應(yīng)量的11%，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與動(dòng)物蛋白相似，且不含膽固醇，是一種較理想的可食用蛋白質(zhì)資源[1]。但相對(duì)于大豆蛋白，花生蛋白的功能性質(zhì)如乳化性、起泡性和凝膠性質(zhì)都比較差，極大限制了其在食品領(lǐng)域的使用[2]。研究超聲波處理對(duì)花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)于改變花生蛋白的功能特性進(jìn)而拓寬花生蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的意義。

超聲波是一種高效可靠的改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的方法，它產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化作用能夠破壞天然蛋白質(zhì)分子之間的非共價(jià)相互作用，使肽鍵斷裂并誘導(dǎo)亞基解離或聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能特性的變化[3]。相較于傳統(tǒng)的幾種物理改性方法如加熱、冷凍、微波、高速攪拌處理和高壓均質(zhì)等，超聲波具有快速有效的改性效果且不損失營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)[4]。石燕等認(rèn)為超聲波處理后酪蛋白某些功能性質(zhì)如起泡性和乳化性等改善，可能是超聲波作用使酪蛋白分子中的螺旋結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，蛋白質(zhì)分子的柔順性增加所致[5]。此外，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理后花生蛋白的表面疏水性增加的同時(shí)有助于提高其乳化性能，其原因可能是超聲作用誘導(dǎo)蛋白質(zhì)解折疊，暴露出更多的疏水基團(tuán)[6]。利用超聲波這種新型物理改性方法，能有效改善花生蛋白的功能性質(zhì)。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)花生蛋白的改性研究主要集中在理化和功能性質(zhì)方面，就超聲波改性對(duì)花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響鮮有報(bào)道。因此，本文以花生蛋白粉為原料，通過(guò)HPLC、SDS-PAGE和FT-IR等方法研究了超聲波改性后花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，研究結(jié)果為超聲波技術(shù)在蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

帝心花生蛋白粉（花生蛋白樣品蛋白含量為42.75%，純化后樣品蛋白含量為70.55%）：河南帝鑫食品有限公司；SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、DC-2006節(jié)能型智能恒溫槽：寧波新芝生物科技股份有限公司；90-2型恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；GL-20C型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京譜析通用儀器有限公司；DDY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；LGJ-25型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的純化

花生蛋白粉→按料液比1∶8（g/mL）加入稀堿液（pH 8.0）→攪拌分散→離心20min（4 000 r/min）→取上清液→調(diào)pH值至4.5→離心15min（4 000 r/min）→收集沉淀→水洗后離心→調(diào)pH值到7.0→沉淀復(fù)溶→4℃透析24 h→冷凍干燥→樣品保存至4℃?zhèn)溆?/p>

1.2.2 花生蛋白溶液的配置

將6 g花生蛋白粉溶于1 L pH 8.0的NaOH溶液，在25℃下以300 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌2 h使花生蛋白均勻分散，待用。

1.2.3 超聲波處理

將超聲波探頭置于花生蛋白懸浮液（70mL）液面下方3 cm處，恒溫水槽控制溫度，設(shè)置超聲波占空比為50%，超聲功率分別為336、672、1 008、1 344、1 680W/cm2；時(shí)間為 10、20、30、40、50min；溫度為 5、15、25、35、45 ℃，超聲波處理樣品凍干備用。

1.2.4 高效凝膠滲透色譜（SE-HPLC）

采用TSK SEC 4000柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行分離。洗脫液為色譜級(jí)乙腈和娃哈哈純凈水（含0.05%三氟乙酸）（體積比），采樣時(shí)間為25min。在280 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量（kDa）如下所述：核糖核酸酶 A（13.7），卵清蛋白（44.3），醛縮酶（150）和甲狀腺球蛋白（670）。每個(gè)樣品平行測(cè)量3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線：log（M）=-0.290 92x+4.714 5；R2=0.990 6。式中：x為出峰保留時(shí)間；M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）

SDS-PAGE電泳依照Laemmli的方法改進(jìn)[7]。制備12%的分離膠，4%的濃縮膠進(jìn)行電泳。將樣品溶解于pH=8的NaOH溶液后與樣品緩沖液 （pH=6.8的0.5mol/LThis-HCl，巰基乙醇，10%SDS 溶液，0.5%的溴酚藍(lán)，甘油，蒸餾水）按1∶1的體積比混合，然后沸水浴4min。取10μL處理后的樣品上樣，采用低分子量蛋白 markers（14 400Da～97 400Da）作為對(duì)照。電極緩沖液為 0.025mol/LTris、0.1%SDS、0.192mol/L 甘氨酸緩沖液，先將電流調(diào)至20mA進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠，再將電流調(diào)至30mA下進(jìn)行1.5 h。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色1.5 h，再用脫色液（95%乙醇、冰醋酸、蒸餾水按體積比25∶8∶67混合）進(jìn)行脫色，直至可以清楚地辨別條帶為止。

1.2.6 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

將1mg干燥后的花生蛋白樣品與100mg干燥的溴化鉀研磨至完全均勻，通過(guò)HY-12型壓片機(jī)和壓片模具，將樣品混合物壓制成透明薄片，掃描其紅外光譜。在分辨率4 cm-1、掃描次數(shù)16次的條件下，采用全反射裝置測(cè)定透明薄片在400 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)的吸收。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波對(duì)花生蛋白分子量及其分布的影響研究

2.1.1 超聲波強(qiáng)度對(duì)花生蛋白分子量分布的影響研究

超聲波強(qiáng)度對(duì)花生蛋白分子量分布的影響如表1所示。

表1 超聲波強(qiáng)度對(duì)花生蛋白分子量分布的影響Table 1 Effectofultrasound intensity on themolecular weight distribution of peanut protein

由表1可知，花生蛋白的分子量主要分布在279.76 kDa～670.00 kDa和 13.69 kDa～54.75 kDa范圍之間。隨著超聲波強(qiáng)度的增大，分子量大于279.76 kDa的蛋白片段整體呈增加趨勢(shì)，而分子量介于13.69 kDa～54.75kDa之間的蛋白片段減少，且分子量小于13.69kDa的蛋白片段隨超聲波強(qiáng)度的增強(qiáng)先增加后減少。結(jié)果表明，低強(qiáng)度超聲波處理花生蛋白有小片段生成，而較高強(qiáng)度超聲波處理可能會(huì)使蛋白發(fā)生聚集，生成大分子量的蛋白片段。此試驗(yàn)結(jié)果與孫英杰等的研究結(jié)果一致[8]。

2.1.2 超聲波時(shí)間對(duì)花生蛋白分子量分布的影響研究

超聲波時(shí)間對(duì)花生蛋白分子量分布的影響如表2所示。

表2 超聲波時(shí)間對(duì)花生蛋白分子量分布的影響Tab le2 Effectof ultrasound tim eon themolecularweight distribution of peanut protein

由表2可知，隨超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，分子量在670.00 kDa以上的蛋白片段顯著增加，而分子量分布在13.69 kDa～54.75 kDa范圍之間的蛋白片段逐漸減少，且在超聲時(shí)間為50min時(shí)達(dá)到最低值；此外，與空白樣品相比，超聲處理后的花生蛋白在分子量低于13.69 kDa處有新片段產(chǎn)生，說(shuō)明超聲作用使蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂，促進(jìn)了小分子的產(chǎn)生，但長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用產(chǎn)生瞬時(shí)極端溫度和壓力導(dǎo)致蛋白變性，暴露出疏水基團(tuán)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集[9]。

2.1.3 超聲波溫度對(duì)花生蛋白分子量分布的影響研究

不同超聲波溫度處理下的花生蛋白分子量分布如表3所示。

由表3可知，與空白相比較，隨超聲波溫度的升高分子量在279.76 kDa～670.00 kDa的蛋白片段增加，并在超聲溫度為45℃時(shí)達(dá)到最大為43.84%；而分子量分布在13.69 kDa～279.76 kDa范圍之間的蛋白片段則逐漸減少，且超聲溫度為25℃時(shí)有少量小分子量片段生成。試驗(yàn)結(jié)果表明，花生蛋白部分亞基發(fā)生了降解，而大分子量片段的生成可能是加熱過(guò)程中R基基團(tuán)發(fā)生聚合現(xiàn)象[10]。

表3 超聲波溫度對(duì)花生蛋白分子量分布的影響Table3 Effectofultrasound temperatureon themolecularweight distribution of peanut protein

2.2 超聲波處理對(duì)花生蛋白亞基的影響研究

超聲波處理對(duì)花生蛋白亞基的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲波處理對(duì)花生蛋白亞基的影響Fig.1 Effectof u ltrasound on the subunitsof peanut protein

2.2.1 超聲波強(qiáng)度對(duì)花生蛋白亞基的影響研究

如圖1A所示為不同超聲波強(qiáng)度處理后花生蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖。該花生蛋白呈現(xiàn)出典型的花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白II。與未經(jīng)超聲波處理的花生蛋白相比，不同超聲波強(qiáng)度處理的花生蛋白條帶分布沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明超聲波強(qiáng)度對(duì)花生蛋白亞基沒(méi)有顯著地影響。

2.2.2 超聲波時(shí)間對(duì)花生蛋白亞基的影響研究

如圖1B所示為不同超聲波時(shí)間處理后花生蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖。與未經(jīng)超聲波處理的花生蛋白相比，不同超聲波時(shí)間處理的花生蛋白在分子量為66.2 kDa附近條帶增加，且在分子量為14.4 kDa處形成新條帶?？赡苁浅暡ㄗ饔闷茐牧颂烊坏鞍拙奂w粒間的非共價(jià)作用，并使其肽鍵斷裂，導(dǎo)致部分蛋白亞基產(chǎn)生了不可逆降解[11]，但隨超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白質(zhì)變性發(fā)生聚集現(xiàn)象。此試驗(yàn)結(jié)果與超聲波時(shí)間對(duì)花生蛋白分子量分布的影響結(jié)果一致。

2.2.3 超聲波溫度對(duì)花生蛋白亞基的影響研究

如圖1C所示為不同超聲波溫度處理后花生蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖。與空白相比，分子量在66.2 kDa附近的條帶有所增加，說(shuō)明有大分子量的片段生成，可能是超聲波作用產(chǎn)生的瞬時(shí)極端溫度和壓力共同導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，暴露出更多的疏水集團(tuán)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。

2.3 超聲波處理對(duì)花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響研究

2.3.1 超聲波處理對(duì)花生蛋白紅外光譜特性的影響研究

超聲波處理對(duì)花生蛋白紅外光譜特性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲波處理對(duì)花生蛋白FT-IR光譜特性的影響Fig.2 Effectof u ltrasonic treatmenton the FT-IR spectra of peanut protein

由圖2可知，花生蛋白的酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）信號(hào)較強(qiáng)，由羰基（C=O）鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，其峰型受蛋白質(zhì)特定二級(jí)結(jié)構(gòu)影響[12]。隨超聲波作用強(qiáng)度的增大和溫度的升高，酰胺I帶吸收峰發(fā)生藍(lán)移，可能是超聲波的空化作用和高溫破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵，使峰位向高波的方向移動(dòng)[13]。由圖2A與2C可以看出，隨超聲波強(qiáng)度和溫度的增加2 400 cm-1附近的吸收峰逐漸減弱甚至消失，可能是由于高強(qiáng)度超聲使花生蛋白肽鍵斷裂，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[14]；而圖2B中此處的吸收峰卻隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，可能是蛋白質(zhì)的聚集所致。

2.3.2 超聲強(qiáng)度對(duì)花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響研究

根據(jù)已有研究，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與各子峰間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為[15]：α-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù)1 650 cm-1～1 658 cm-1，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù) 1 660 cm-1～1 700 cm-1，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù) 1 640 cm-1～1 650 cm-1，β-折疊結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù)為1 610 cm-1～1 640 cm-1。采用Peakfit軟件對(duì)蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行傅里葉去卷積光譜擬合分析，通過(guò)峰位歸屬確定二級(jí)結(jié)構(gòu)種類和含量，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 超聲波對(duì)花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table4 Effectof ultrasound on thesecondary structureof peanut protein%

由表4可以看出，花生蛋白主要組成為β-轉(zhuǎn)角，占二級(jí)結(jié)構(gòu)總量的36.50%。與空白相比，超聲波處理后花生蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)比例整體呈下降趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例增加，超聲波處理形成的“空穴效應(yīng)”及伴隨著溫度升高，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞作用比較明顯，易造成二級(jí)結(jié)構(gòu)的相互轉(zhuǎn)化[16]。而不同超聲波強(qiáng)度處理組之間花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化并無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明超聲波強(qiáng)度對(duì)花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響并不顯著。

隨超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，花生蛋白的α-螺旋、β-折疊以及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比例無(wú)顯著變化；而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例雖逐漸減少，但其含量相比于未經(jīng)超聲波處理樣品均有不同程度增加，可能是超聲波處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加松散，導(dǎo)致β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例增加，但隨超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)變性暴露出更多的疏水集團(tuán)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集，進(jìn)而使其比例減少[17]。經(jīng)不同超聲波溫度處理后，花生蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)比例有所降低，但各溫度之間并無(wú)顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)超聲波溫度為5℃時(shí)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例最大為37.04%；當(dāng)溫度升高到15℃時(shí)其比例略有降低，可能是加熱過(guò)程中氫鍵斷裂所致[18]。

3 結(jié)論

超聲波改性使花生蛋白低分子量（13.69 kDa～54.75 kDa）片段分布比例降低，高分子量（＞279.76 kDa）片段分布比例增加。電泳結(jié)果顯示，超聲波作用后花生蛋白亞基片段發(fā)生了不同程度的降解，但隨超聲波作用的增強(qiáng)，部分蛋白質(zhì)發(fā)生了聚集。通過(guò)紅外光譜對(duì)花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn)，超聲波改性后花生蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，而β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)無(wú)顯著變化；研究結(jié)果表明，超聲波處理能夠使花生蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。花生蛋白結(jié)構(gòu)的改變勢(shì)必會(huì)對(duì)其功能性質(zhì)產(chǎn)生影響，而超聲波對(duì)花生蛋白功能性質(zhì)影響的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，以便指導(dǎo)超聲波技術(shù)更好地應(yīng)用于蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域。

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