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    貝母提取物對(duì)異丙腎上腺素致小鼠心肌纖維化的作用*

    2018-05-15 03:51:39裴宸晨
    關(guān)鍵詞:膠原纖維細(xì)胞纖維化

    裴宸晨,李 樂

    (1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥劑14級(jí),2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥理研究所,杭州310014)

    心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量增加,心肌間質(zhì)膠原過度沉積所致。MF破壞心臟功能,可促發(fā)充血性心力衰竭、惡性心律失常和猝死。MF常繼發(fā)于冠心病、高血壓等心血管疾病,也是心室重構(gòu)發(fā)展難以逆轉(zhuǎn)的重要原因,因此預(yù)防及控制MF具有重要的臨床意義[1]。

    傳統(tǒng)中藥貝母能清熱止咳化痰?,F(xiàn)代研究證明其在抗炎、抗腫瘤、降血壓、抗氧化等方面藥理活性強(qiáng),尤其抗炎方面[2]。貝母在抗炎,抗氧化等方面效果顯著,由此推測(cè)其可能對(duì)MF具有防治作用。為此本實(shí)驗(yàn)觀察貝母提取物(fritillaria extract,F(xiàn)E)對(duì)小鼠MF的影響,探討其治療異丙腎上腺素(isoproterenol,Iso)誘導(dǎo)MF作用及其可能機(jī)制,此類實(shí)驗(yàn)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康昆明種小鼠,18~22 g,雌雄兼用,浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(浙)20160013;光照 12 h,明暗交替,正常飲食飲水,實(shí)驗(yàn)處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2 藥品、試劑及主要儀器

    FE,浙江省湖州生物技術(shù)公司,生料比10∶1;Iso,上海禾豐制藥有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒,南京建成生物公司;山羊抗鼠TGF-β1多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體,武漢博士德生物技術(shù)公司;倒置顯微鏡XDS-1B型,重慶光學(xué)儀器廠;Synergy H1多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司;80-2型低速離心機(jī),上海醫(yī)療器械集團(tuán)公司。

    1.3 小鼠MF模型復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組、給藥

    昆明種小鼠40只,隨機(jī)均分為對(duì)照組、Iso模型組、Iso+FE 300 mg/kg組、Iso+FE 900 mg/kg組(n=10)。除對(duì)照組外,其余各組每只小鼠 i.h Iso 1.5 mg/kg(0.3 ml/d),連續(xù) 14 d,對(duì)照組s.c等量生理鹽水;同時(shí),Iso+FE低、高劑量組分別0.4 ml/d,0.9 ml/d灌胃 FE,連續(xù) 30 d,而對(duì)照組和 Iso模型組以等量生理鹽水灌胃。

    1.4 心重指數(shù)測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠稱重,眼球取血,3 000 r/min,離心 10 min,取上清液用于SOD,MDA測(cè)定;處死小鼠取心臟,稱重,計(jì)算心重指數(shù)(heart weight/body weight,HW/BW)。

    1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

    1.6 左心室組織病理學(xué)檢查

    每組取10只小鼠心尖組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋制成5μm切片,分別進(jìn)行HE及Masson染色,顯微鏡觀察下心肌組織學(xué)的改變。

    取上清液,按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作,測(cè)定SOD活性及MDA含量。

    1.7 免疫組化法檢測(cè)小鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)

    取小鼠左心肌組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片。然后脫蠟、水化,3%H2O2室溫封閉10 min,羊血清封閉液室溫封閉30 min。滴加各種1抗(TGF-β1),4℃濕盒過夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后滴加1∶100辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgGⅡ抗,室溫孵育30 min,PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶,DAB顯微鏡下控制顯色,蘇木素復(fù)染。顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒(TGF-β1陽性)、攝像,Quantity One分析軟件測(cè)定陽性顆粒光密度值。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來表示,多組間數(shù)據(jù)用One-way ANOVA方法分析,兩組間比較采用 t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 心重指數(shù)的變化

    與對(duì)照組相比,Iso模型組小鼠心重指數(shù)明顯增加(P<0.01);經(jīng)FE治療后,與Iso模型組相比,F(xiàn)E高、低劑量組心重指數(shù)明顯降低(P<0.05,P<0.01,表 1)。

    2.2 小鼠血清SOD活性、MDA含量

    與Iso模型組比較,Iso FE治療組小鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.05),而 MDA含量顯著降低(P<0.05,表 2)。

    Tab.1 Changes of heart weight index of mice(±s,n=10)

    Tab.1 Changes of heart weight index of mice(±s,n=10)

    FE:Fritillaria extract;Iso:Isoproterenol;HW:Heart weight;BW:Body weight*P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs iso model group

    Group Dose(mg/kg) BW(g) HW(mg) HW/BW(mg/g )Control - 26.12±3.34 114.36±16.06 3.73±0.46 Iso model - 23.60±7.79 112.67±34.30 4.85±0.50**Iso+FE 300 31.80±2.17 143.97±9.01 4.54±0.37#Iso+FE 900 28.03±2.90 117.06±10.60 4.14±0.31##

    Tab.2 Levels of SODand MDA in serum of mice(±s,n=10)

    Tab.2 Levels of SODand MDA in serum of mice(±s,n=10)

    FE:Fritillariaextract;SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde*P<0.05 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Isomodel group

    Group Dose(mg/kg) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml )Control - 49.54±6.86 289.41±83.43 Iso model - 41.42±11.12*321.18±31.09*Iso+FE 300 45.16±2.27#298.38±41.04#Iso+FEt 900 55.25±7.58##293.93±31.28##

    2.3 左心室組織病理學(xué)變化

    對(duì)照組心肌組織排列整齊,間隙正常;Iso模型組細(xì)胞間隙增加,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),形態(tài)不規(guī)整,胞核深染;比較Iso模型組,F(xiàn)E給藥組炎性浸潤(rùn)程度均不同程度下降,胞間間隙減小,壞死或膨大細(xì)胞減少(圖1,見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

    Fig.1 Changes of cardial tissues in eacy group(HE ×100)

    Masson染色顯示心肌組織膠原纖維呈藍(lán)綠色,心肌纖維呈紅色。對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常,纖維排列致密整齊,模型組有大量膠原纖維沉積并向鄰近肌束延伸,Iso+FE治療組雖仍有膠原沉積,但較Iso模型組膠原沉積顯著減少,炎癥明顯減輕(圖2,見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

    Fig. 2 Pathology changes of cardial tissues in each group mice(Masson ×200)

    2.4 免疫組化法檢測(cè)TGF-β1表達(dá)的變化

    Iso模型組棕褐色顆粒TGF-β1表達(dá)明顯高于對(duì)照組,呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。與對(duì)照組相比,F(xiàn)E低劑量治療組TGF-β1蛋白表達(dá)水平仍較高,但與Iso模型組相比降低。而高劑量FE組TGF-β1蛋白表達(dá)則顯著減少(圖3,見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

    Fig. 3 Expression of TGF-β1 on cardial tissues of each group(Immunohistochemistry ×100)

    3 討論

    MF主要以心肌纖維細(xì)胞異常增殖與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量沉積為重要特點(diǎn)的病理改變,是多種心血管疾病共同的病理基礎(chǔ);目前臨床多用β腎上腺素受體阻斷劑,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等對(duì)抗,療效不佳且難以持久用藥[3]。

    本研究顯示,應(yīng)用Iso造模后,F(xiàn)E高劑量組心重指數(shù),與Iso模型組比較明顯減小,表明FE能有效地抑制模型小鼠的心肌肥厚。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí)FE對(duì)Iso所致MF小鼠的心肌細(xì)胞纖維化程度、炎性浸潤(rùn)水平均有改善,且升高血清 SOD活性,降低MDA含量。推測(cè)FE可能通過清除氧自由基,減輕脂質(zhì)過氧化損傷,對(duì)心肌肥厚及MF起到保護(hù)作用。

    大量研究顯示,在心肌損傷時(shí),成纖維細(xì)胞被激活增殖為肌成纖維細(xì)胞,TGF-β1等活性分子促進(jìn)MF,刺激成纖維細(xì)胞活化,上調(diào)I、III型膠原合成并抑制膠原酶釋放,調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì),增加纖維蛋白膠原和蛋白聚糖,抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解;通過下游Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[4];同時(shí),TGF-β1介導(dǎo) RAAS活化 Ang II升高誘導(dǎo)的 MF[5]。本實(shí)驗(yàn)提示FE可以抑制Iso誘發(fā)的心肌組織成纖維細(xì)胞活化,下調(diào) TGF-β1蛋白表達(dá)。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證實(shí),F(xiàn)E能有效對(duì)抗Iso誘發(fā)的MF,降低Iso造成的血清SOD活性降低,升高M(jìn)DA含量。其抗MF機(jī)制與FE清除氧自由基,減輕脂質(zhì)過氧化損傷,抑制TGF-β1表達(dá)有關(guān),其深層機(jī)制待進(jìn)一步研究。

    【參考文獻(xiàn)】

    [1] Broberg CS,Burchill LJ.Myocardial factor revisited:The importance of myocardial fibrosis in adults with congenital heart disease[J].Int J Cardiol,2015,189:204-210.

    [2] Yu Q,Zhang Y.Transforming growth factor-β1 mediates NADPH oxidase 4:A significant contributor to the pathogenesis of myocardial fibrosis[J].Int J Cardiol,2017,227:53-54.

    [3] Gao X,He X,Luo B,et al.Angiotensin II increases collagen I expression via transforming growth factor-beta1 and extracellular signal-regulated kinase in cardiac fibroblasts[J].Eur J Pharmacol,2009,606(1-3):115-120.

    [4] 張冠軍,張蔚屏,王開成,等.厄貝沙坦對(duì)抗糖尿病大鼠心肌纖維化作用及機(jī)制[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2016,32(3):220-224.

    [5] Li Y,Yang Y,Yu D,et al.The effect of tanshinone IIA upon the TGF-beta1/Smads signalingpathway in hypertrophicmyocardium of hypertensive rats[J].JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2009,29(4):476-480.

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