三種磁珠法提取脫落細(xì)胞DNA的比較

王華榮，廖勤，吳世青

（1.滄州市公安局刑警支隊(duì)，河北滄州 061000；2.唐山市公安局刑警支隊(duì)，河北唐山 063000）

三種磁珠法提取脫落細(xì)胞DNA的比較

王華榮1，廖勤2，吳世青1

（1.滄州市公安局刑警支隊(duì)，河北滄州 061000；2.唐山市公安局刑警支隊(duì)，河北唐山 063000）

法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA；提取法；磁珠法；脫落細(xì)胞

法醫(yī)DNA鑒定中的脫落細(xì)胞檢材是指含有人體皮膚黏膜脫落上皮細(xì)胞的檢材，是當(dāng)前刑事案件現(xiàn)場最有可能提取到的生物物證。目前關(guān)于脫落細(xì)胞提取純化方法對比的報(bào)道[1-3]較多，但相同提取方法效果橫向比較的研究較少。本研究對IQ磁珠、M48磁珠、PrepFiler磁珠三種常見的磁珠法提取脫落細(xì)胞DNA的檢驗(yàn)效果進(jìn)行比較，為法庭科學(xué)實(shí)踐提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

50例脫落細(xì)胞類檢材均取自本實(shí)驗(yàn)室2013—2015年檢案積累，包括10枚煙蒂、10個(gè)飲料瓶、10件衣物（含手套、帽子）、10枚汗液指紋膠帶及10例作案工具（手柄）。

1.2 方法

1.2.1 前處理

煙蒂及膠帶上指紋采取剪取法，飲料瓶及作案工具采取擦拭法［4N6FLOQSwabsTM植絨拭子[4]（美國AB公司）］，衣物采取吸取法［生物脫落細(xì)胞提取儀[5]（北京貝斯湃生物技術(shù)有限責(zé)任公司）］。每份樣本平均分配至3個(gè)微量離心管中備檢。

1.2.2 DNA提取

IQ磁珠法：使用Maxwell?16自動純化儀（美國Promega公司）按照儀器及IQ磁珠試劑盒（美國Promega公司）相關(guān)說明進(jìn)行DNA抽提。

M48磁珠法：采用MagAttract M48 DNA Manual試劑盒（德國QIAGEN公司），按照公安部物證鑒定中心IFSC-02-02-05-2010《M48手工提取方法》進(jìn)行DNA抽提。

PrepFiler磁珠法按照PrepFiler?BTA Forensic DNA Extraction試劑盒（美國AB公司）操作說明書進(jìn)行DNA抽提。

1.2.3 DNA擴(kuò)增、檢測及分析

采用AmpFlSTR?Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）10μL體系（包括緩沖液4μL，超純水3μL，引物2 μL和模板DNA 1 μL），在9700型PCR擴(kuò)增儀（美國AB公司）上按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用3130xl型遺傳分析儀（美國AB公司）進(jìn)行檢測，GeneMapper ID v3.2軟件分析結(jié)果。

磁珠提取法檢驗(yàn)成功的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：樣本所有基因座均能正確分型，獲得的譜峰峰高大于300相對熒光單位（RFU），雜合子兩個(gè)峰高比例在70%以上[6]，無或少雜峰等干擾因素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行多組樣本間的非參數(shù)檢驗(yàn)和組間的兩兩比較，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較各組間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

表1 三種磁珠法提取五類檢材檢驗(yàn)的成功結(jié)果［n=10，例（%）］

2.1 結(jié)果

2.1.1 檢驗(yàn)成功率

五類檢材三種磁珠法提取檢驗(yàn)獲得成功結(jié)果情況見表1。對磁珠法、檢材類型的不同檢驗(yàn)成功率進(jìn)行交互比較，發(fā)現(xiàn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三種常見磁珠法脫落細(xì)胞檢驗(yàn)成功率：PrepFiler磁珠法［45例（90%）］＞M48磁珠法［43例（86%）］＞IQ磁珠法［26例（52%）］。五類檢材脫落細(xì)胞檢驗(yàn)成功率：煙蒂［30例（100%）］＞衣物［26例（87%）］＞飲料瓶［24例（80%）］＞作案工具［18例（60%）］＞汗液指紋［16例（53%）］。

2.1.2 圖譜均衡性及峰高

五類檢材采用三種磁珠法提取檢驗(yàn)獲得成功結(jié)果的峰高均值和雜合子均衡性見表2。PrepFiler磁珠法與M48磁珠法的峰高及均衡性差異不明顯，但均好于IQ磁珠法。對PrepFiler磁珠法、M48磁珠法與IQ磁珠法的峰高進(jìn)行同一樣本對比，發(fā)現(xiàn)三種方法均檢驗(yàn)成功的樣本中有21例（81%）在PrepFiler磁珠法與M48磁珠法的峰高為IQ磁珠法的1.5～2.5倍。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，檢測得到的峰高均值越高，雜合子均衡性越好。

表2 三種磁珠法提取五類檢材獲得的峰高均值和雜合子均衡性（n=10）

3 討論

三種磁珠法均利用細(xì)胞裂解液和蛋白酶促使細(xì)胞膜、核膜破裂釋放DNA，通過磁珠作為載體在相關(guān)試劑盒試劑制造的環(huán)境下結(jié)合DNA，利用磁力架（棒）富集磁珠，并洗滌、純化去除干擾雜質(zhì)后，將DNA釋放于體積相對較少、DNA模板濃度較高的洗脫液中。此過程起到提取、純化、富集的作用，因此磁珠法對于污染重、微量的脫落細(xì)胞DNA的提取具有較大優(yōu)勢。

本研究中，五種不同類型脫落細(xì)胞檢材樣本的檢驗(yàn)除采用不同的磁珠提取方法外，余實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均保持完全一致，確保無其他可能的因素影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，對于煙蒂檢材因其含有的模板DNA量較大，三種磁珠法均能獲得理想的效果；對于飲料瓶、衣物類檢材其含有的模板DNA量或多或少，PrepFiler磁珠法與M48磁珠法獲得的圖譜峰高均值更大，檢驗(yàn)成功率更高；對于汗液指紋、作案工具等接觸類檢材其含有的模板DNA量較少，PrepFiler磁珠法與M48磁珠法獲得的檢驗(yàn)成功率更高。以上結(jié)果均表明PrepFiler磁珠法與M48磁珠法對DNA具有更好的吸附或釋放性能，相比IQ磁珠法更適合于脫落細(xì)胞中微量模板DNA的提取檢驗(yàn)，在實(shí)際檢案應(yīng)用中更具優(yōu)勢。

[1]楊電，劉超，徐曲毅，等.DNA IQ磁珠法結(jié)合Maxwell? 16自動儀提取接觸DNA[J].刑事技術(shù)，2011，（3）：3-5.

[2]徐程，豐蕾，楊帆，等.微量接觸DNA的濃縮與回收[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（6）：532-535.

[3]駱繼懷，陳曉軍，孫紅兵，等.接觸性生物檢材提取DNA方法的比較[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，41（1）：18-22.

[4]徐海軍，葉志鵬，徐姚力，等.植絨和棉簽拭子對不同載體微量生物物證的提取研究[J].刑事技術(shù)，2015，（5）：373-375.

[5]陳殿宇，郝金萍，張忠祥，等.生物脫落細(xì)胞提取儀在案件檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].刑事技術(shù)，2008，（2）：58-59.

[6]巴華杰，林子清，劉亞楠，等.5種免提取試劑盒檢驗(yàn)濾紙血痕結(jié)果的比較[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（1）：49-51.

（本文編輯：張素華）

更正聲明

各位讀者，2016年第5期《鈍器致鼻部骨折95例法醫(yī)學(xué)分析》一文，有一處筆誤，現(xiàn)更正如下：第355頁“3.5完善鑒定標(biāo)準(zhǔn)的思考和建議”中第一段第四行“上頜骨額突骨折合并鼻中隔骨折按《舊標(biāo)準(zhǔn)》……”，更正為“單純鼻骨骨折（無明顯移位）合并鼻中隔骨折在《舊標(biāo)準(zhǔn)》中并無明確規(guī)定，實(shí)踐中存在爭議”。特此聲明。

《法醫(yī)學(xué)雜志》編輯部

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.018

1004-5619（2016）06-0459-02

2016-06-03）

王華榮（1966—），男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)物證學(xué)鑒定與研究；E-mail：wushiqing507＠sohu.com