自動(dòng)化高通量提取脫落細(xì)胞檢材DNA

趙春鶴，郭業(yè)明，巫家盛

（1.東莞市公安局刑警支隊(duì)，廣東東莞 523008；2.東莞市公安局交警支隊(duì)，廣東東莞 523000）

自動(dòng)化高通量提取脫落細(xì)胞檢材DNA

趙春鶴1，郭業(yè)明2，巫家盛1

（1.東莞市公安局刑警支隊(duì)，廣東東莞 523008；2.東莞市公安局交警支隊(duì)，廣東東莞 523000）

法醫(yī)遺傳學(xué)；提取法；高通量篩選分析；自動(dòng)化；脫落細(xì)胞

脫落細(xì)胞是目前法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中的重要檢材之一，此類物證具有體積小、較為隱蔽、不易察覺、不易毀滅等特點(diǎn)。通過提取脫落細(xì)胞中的DNA，可以直接獲取犯罪現(xiàn)場(chǎng)人員信息，為案件偵破提供重要技術(shù)支持。但在現(xiàn)場(chǎng)檢材中通常僅能采集到微量的脫落細(xì)胞，且常常帶有擴(kuò)增抑制物，手工進(jìn)行DNA提取操作復(fù)雜，提取效果因人而異，給DNA檢驗(yàn)帶來了諸多困難。為有效提高脫落細(xì)胞的獲取量，必然要增加現(xiàn)場(chǎng)采樣的數(shù)量，這又大大增加了后續(xù)DNA提取的工作強(qiáng)度。目前，建立自動(dòng)化、高通量的提取脫落細(xì)胞檢材DNA的有效方法已經(jīng)成為法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的重要研究方向。本研究以KingFisherTMFlex微量生物物證DNA自動(dòng)化提取純化系統(tǒng)（高通量版，以下簡稱KingFisher Flex系統(tǒng)）為基礎(chǔ)，建立自動(dòng)化高通量提取脫落細(xì)胞檢材DNA的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集實(shí)際檢案中的脫落細(xì)胞檢材274份，包括口腔黏膜上皮脫落細(xì)胞檢材60份，其中礦泉水瓶口33份、牙刷12份、食物咬痕8份、筷子牙簽等餐具7份；皮膚上皮脫落細(xì)胞檢材214份，其中電線插座插頭、欄桿、工具握柄及把手165份，手套32份，衣帽17份。

1.2 主要儀器與試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀、3500型基因分析儀、3130xl型遺傳分析儀（美國AB公司），KingFisher Flex系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司），脫落細(xì)胞粘取器（東莞市公安局研發(fā)）；案件專用磁珠法DNA提取試劑盒（長春市博坤生物科技有限公司），Identifiler? Plus試劑盒（美國AB公司）。

1.3 脫落細(xì)胞DNA的提取

口腔黏膜上皮脫落細(xì)胞采用公安部物證鑒定中心研制的生物物證棉簽[1]提取，皮膚上皮脫落細(xì)胞采用脫落細(xì)胞粘取器[2]提取，在脫落細(xì)胞可能存在的部位反復(fù)粘取和擦拭（至少20次）。然后將剪下的棉簽頭或膜片放入1mL離心管中，加入400μL消化液（液面高度要超過棉簽或膜片）和10 μL蛋白酶K（質(zhì)量濃度20 mg/mL），56℃條件下消化1 h，以離心半徑5 cm，10 000 r/min，離心3 min，取上清液按照案件專用磁珠法DNA提取試劑盒說明書和KingFisher Flex系統(tǒng)預(yù)設(shè)程序進(jìn)行DNA提?。ò磧x器處理通量分3批次進(jìn)行提取）。DNA洗脫體積為40μL。

1.4 PCR擴(kuò)增及熒光檢驗(yàn)

用Identifier?Plus試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為12.5 μL，含DNA模板5 μL、反應(yīng)混合液5μL、引物2.5μL。反應(yīng)在9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，95℃11 min；94℃20 s，59℃60 s，72℃60 s，34個(gè)循環(huán)；60℃10min[3]。用3130xl型遺傳分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用GeneMapper ID 3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及等位基因分型。

2 結(jié)果

從表1可以看出，本研究建立的自動(dòng)化高通量處理方法得到的DNA檢驗(yàn)總成功率約為50%。從提取時(shí)間來說，同時(shí)對(duì)90個(gè)裂解好的樣品進(jìn)行DNA提取，KingFisher Flex系統(tǒng)只需要50min。

表1 利用KingFisher Flex系統(tǒng)提取DNA檢驗(yàn)結(jié)果（份）

3 討論

KingFisher Flex微量生物物證DNA自動(dòng)化提取純化系統(tǒng)，在同一批次內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行96個(gè)樣品的純化，除去陰陽性對(duì)照樣品外，每次可完成92個(gè)樣品的DNA提取純化。

應(yīng)用KingFisher Flex系統(tǒng)結(jié)合ML案件專用磁珠法DNA提取試劑盒，對(duì)脫落細(xì)胞檢材進(jìn)行自動(dòng)化高通量提取純化方法的適用面非常廣，本研究收集的檢材種類包括紡織物、金屬表面、木器表面等，基本涵蓋了大部分的現(xiàn)場(chǎng)檢材。

本研究建立的方法是以KingFisher Flex系統(tǒng)為基礎(chǔ)，優(yōu)化了脫落細(xì)胞檢材的采集、處理和DNA提取等各個(gè)環(huán)節(jié)的技術(shù)操作。主要表現(xiàn)在：（1）在采集環(huán)節(jié)，對(duì)皮膚上皮脫落細(xì)胞廣泛應(yīng)用脫落細(xì)胞粘取器進(jìn)行采集，與傳統(tǒng)的棉簽提取方式相比，操作直觀簡單，基層技術(shù)人員運(yùn)用難度低，獨(dú)立的包裝盒防污染、防霉效果好，細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率較高且穩(wěn)定[2]；（2）為消除在細(xì)胞粘取過程中夾帶的雜質(zhì)對(duì)擴(kuò)增的抑制，本研究選擇了新型的案件專用磁珠法DNA提取試劑盒，該試劑盒提取靈敏度能夠達(dá)到30pg，適合微量、污染和降解檢材提取純化使用；（3）KingFisher Flex系統(tǒng)使用的是磁珠轉(zhuǎn)移的提取方式，與液體轉(zhuǎn)移提取方式相比，提取效率和純化效率有明顯優(yōu)勢(shì)，與手工提取基本一致。本研究結(jié)果表明，通過以上優(yōu)化方法，結(jié)合自動(dòng)化高通量提取儀器建立的自動(dòng)化批量處理脫落細(xì)胞檢材的方法非常有效地解決了各種檢材脫落細(xì)胞提取的難題，為DNA分析技術(shù)在刑事案件偵破中發(fā)揮重大作用提供了強(qiáng)有力的支持。

本方法中KingFisher Flex系統(tǒng)所需的提取時(shí)間比手工操作提取縮短數(shù)十倍，并且適用檢材范圍廣，在保證提取質(zhì)量的前提下，降低了操作人員的工作強(qiáng)度和難度，縮短了工作時(shí)間，減少了人工操作的失誤，極大地提升了工作效率。

[1]張璐.微量DNA檢驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用——微量DNA檢驗(yàn)技術(shù)及展望[J].警察技術(shù)，2012，（2）：3-6.

[2]趙春鶴，郭業(yè)明，江煜靈，等.利用自研新型脫落細(xì)胞粘取器提取接觸類檢材DNA[J].刑事技術(shù)，2014，（4）：51-53.

[3]陳連康，王德明，顧麗華，等.PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與低拷貝模板DNA的STR分型[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（3）：149-151.

（本文編輯：李成濤）

書訊

由司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所黃平、鄒冬華主編的《法醫(yī)病理學(xué)研究前沿》已于2015年2月由科學(xué)出版社出版發(fā)行。該書綜合了國內(nèi)外大量文獻(xiàn)資料中的法醫(yī)病理學(xué)研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，論述了一大批新技術(shù)、新方法、新理論在法醫(yī)病理學(xué)研究、鑒定中的應(yīng)用情況，對(duì)相關(guān)研究成果進(jìn)行了及時(shí)總結(jié)、歸納與提煉，系統(tǒng)闡述了皮膚損傷時(shí)間推斷、紅外光譜技術(shù)、過敏性休克死亡、虛擬解剖、損傷生物力學(xué)與交通傷重建、國外法醫(yī)病理學(xué)體制、國外尸體解剖標(biāo)準(zhǔn)、國外法醫(yī)學(xué)體制、國外尸體解剖鑒定文書賞析等內(nèi)容，這些相關(guān)技術(shù)的提出及應(yīng)用將有助于促進(jìn)法醫(yī)病理學(xué)鑒定和科研水平的整體進(jìn)步。

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10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.017

1004-5619（2016）06-0457-02

2016-02-24）

趙春鶴（1976—），女，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA檢驗(yàn)鑒定；E-mail：13929218636@139.com