腫瘤血管抑制劑Combretastatins的重要中間體CA4酸質量研究

孫嘉茵　李宇茜　熊小平　樊淑宏　羅婷婷　雍志全　徐小平

摘要：對Combretastatin系列化合物的重要中間體CA4酸（CA4s）理化特征、有關物質、殘留溶劑和含量測定的方法進行系統(tǒng)研究。通過IR、UV、MS、NMR等確定本品的化學結構。采用HPLC法檢測有關物質，條件為：色譜柱C18（150mm×4.60mm，5μm），流動相（體積比）：0.1%甲酸（氨水調解pH至6.8）-甲醇-乙腈（75：22：3），檢測波長為220nm；采用HS-GC法檢測殘留溶劑，條件為：PEG20M（30m×0.53mm，1μm）的石英毛細管柱，柱溫80℃，檢測器溫度250℃（FID），進樣口溫度200℃，流量4.0mL/min，分流比：10：1；采用LC-MS鑒定本品有關物質；以剩余滴定法測定本品的含量。結果表明：CA4酸為難溶于水的淺黃色結晶性粉末，其化學結構與2-（3，4，5-三甲氧苯基）-3-[3-羥基-4-甲氧苯基卜丙烯酸相吻合，有6個雜質組分，經鑒定雜質5和雜質2為三甲氧基苯乙酸和異香草醛；雜質6為z式CA4酸，受光照影響發(fā)生較大的變化反映出順反異構的特征；殘留溶劑乙醇量小于0.08%。CA4酸為Combretastatinl類化合物的關鍵中間體，難溶于水，分子中的羧基可與堿性化合物作用生成可溶性的鹽，可突破該類化合物難溶性瓶頸，提高該類化合物抑制腫瘤血管的效率，是一個具有較高價值Combretastatins中間體或先導化合物。

關鍵詞：CA4酸；抗腫瘤藥；高效液相色譜；氣相色譜

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（2018）02-0041-07

0引言

Combretastatin類化合物是近年來發(fā)現的一類腫瘤血管抑制劑，其二苯乙烯母核的結構發(fā)現于南非灌木柳樹Combretumcaffrum的樹皮中，是一類具有順式二苯乙烯結構的天然產物，其抗腫瘤作用機理與秋水仙堿結構類似，是通過競爭抑制與微管蛋白相結合，從而發(fā)揮其抗有絲分裂的作用，達到抑制微管形成，阻滯細胞增殖以及抗血管活性的效果。在這類化合物中，Combretastatin A-4（CA4）具有最佳的微管抑制效果及體外細胞毒性，且對有異常結構特征和功能的腫瘤血管具有靶向抑制性，對正常血管作用較小，因而全身毒性較小且不易產生耐藥性，因而備受關注。但由于CA4具有水溶性較差且難以保持其有效構型等缺點，限制了其臨床應用。對該類化合物結構修飾并改善其水溶性是解決它們最終抗癌作用的關鍵，包括骨架及基團修飾和合成氨基糖類衍生物等。近年，國內外相繼開發(fā)出的CA4磷酸鹽前藥CA4P已進入II、III期臨床試驗。

本文在CA4和CA4P研究的基礎上，發(fā)掘一種具有酸性結構的中間體——CA4酸（CA4s），可以通過成鹽產生具有良好水溶性的化合物，從而突破這類化合物的瓶頸。采用3，4，5-三甲氧基苯乙酸和異香草醛在乙酸酐和三乙胺中進行Perkin縮合反應，經濃鹽酸處理，并經無水乙醇重結晶精制，得到（E）-3-（3-羥基-4-甲氧基苯基）-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）-丙烯酸（即CA4s，路線見圖1）。近期，CA4s與有機胺結合產生的DX1002作為腫瘤血管抑制劑已經申請國家一類創(chuàng)新藥臨床試驗，而CA4s的質量控制成為DX1002質量的關鍵，建立中間體CA4s的質量標準具有非常重要的意義，由于CA4s為首次開發(fā)，暫無直接的研究報道，本文根據CA4s合成特點，針對其化學結構、性質和質量特征進行系統(tǒng)研究，確證其化學結構、性狀、種類，檢查其有關物質、建立含量測定方法，為進一步深入研究開發(fā)DX1002系列化合物提供中間體的分析方法和物質基礎。

1實驗部分

1.1儀器和試劑

LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津），SPD-20A紫外/可見檢測器（日本島津），SePu3000色譜工作站（杭州普惠科技有限公司）；Nicolet Impact 410型紅外光譜儀（美國Nicolet儀器公司）；UV-2300紫外-可見分光光譜儀（上海天美科學儀器有限公司）；GC7890F氣相色譜儀（FID，上海天美科學儀器有限公司）；Varian UNITY INOVA型400核磁共振譜儀（美國Nicolet儀器公司）；軌道阱高分辨質譜系統(tǒng)（LTQ Orbitrapelite美國熱電分析儀器公司）；pHS-3C型酸度計（成都方舟科技開發(fā)公司）；Sartorious BT 125D十萬分之一電子（德國Sartorius）；SHANGPING FA2004萬分之一電子天平（上海天平儀器廠）；KL10260D型超聲波清洗器（上海荊和分析儀器有限公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥器（上海精宏實驗設備有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（成都市予華偉業(yè)儀器有限公司）；超純水機（成都品成科技有限公司）；旋渦振蕩器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）。

CA4s樣品及其順式結構樣品（自制，東莞達信生物技術有限公司）；異香草醛對照品（Adamas Reagentco.，Ltd.，批號：P1097634）和3，4，5-三甲氧基苯乙酸對照品（Adamas Reagentco.，Ltd.，批號：P03109）；氫氧化鈉（AR，天津市科密歐化學試劑有限公司）；濃硫酸（AR，成都市天華科技股份有限公司）；甲醇（HPLC，天津科密歐化學試劑有限公司）；乙腈（HPLC，進口分裝）；氨水（AR，廣東光華科技股份有限公司）；無水乙醇（HPLC，天津科密歐化學試劑有限公司）；水為純水機自制超純水。

1.2方法

1.2.1CA4s的結構確證

分別通過核磁共振（NMR）、質譜（MS）、紅外分光光度法（IR）和紫外分光光度法考察（CA4s）的結構。

1.2.2CA4s的理化性質測定

1）性狀的考察。取潔凈濾紙一張，挑取樣品少許置于其上，平鋪均勻，于自然光下觀察。取3份樣品適量，分別置于高溫（60℃）、高濕（相對溫度為92.5%）和光照（4500k）條件下1h，觀察外觀變化。

2）溶解度的考察。照ChP.2015凡例要求，稱取樣品適量，于（25±2）℃條件下，加入待考察的溶劑適量，每隔5min強力振搖30s，觀察溶解情況?？疾烊軇┌ǎ核⒓状?、乙醇、丙酮、氯仿、DMSO、DMF。

3）pH的考察。取樣品適量，加超純水配制飽和溶液，測定pH。

4）酸、堿條件下紫外圖譜。取樣品適量，精密稱定，分別加0.1mol/LhCl溶液和0.1mol/LnaOH溶液制成含量為20μg/mL的溶液，在波長200～400nm進行紫外掃描。

1.2.3有關物質的研究

1）色譜條件的確定

以CA4P分離色譜條件為基礎，確定對CA4s的色譜條件為C18（150mm×4.60mm，5μm）；流動相比例（體積比）為0.1%甲酸（pH 6.8）-甲醇-乙腈（75：22：3），柱溫30℃，流量1mL/min。

2）方法學驗證

照上述建立的CA4s有關物質HPLC檢測條件進行了相關方法學驗證，內容包括：1）專屬性試驗；2）檢測限與定量限的測定；3）精密度試驗（進樣精密度、重復性精密度及中間精密度）。

3）重要有關物質的鑒定研究

根據CA4s合成工藝及其有關物質分離結果表明，本品除了來自原料的異香草醛、三甲氧基苯乙酸外，受溫度和光照影響最明顯的為本品主峰后的雜質峰，為此，采用LC/MS對雜質進一步鑒定。色譜條件為ODS（4.6mm×250mm）色譜柱：流動相0.1%甲酸（氨水調pH 6.8）-甲醇-乙腈=75：22：3，流量1mL/min，進樣量為10μL，柱溫40℃：質譜條件為安捷倫三重串聯四級桿質譜，干燥氣為氮氣，氣體溫度：350℃，流量：11L/min，電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓：4kV，霧化氣壓力：40psi（1psi=6.895kPa），裂解電壓：75V，離子化方式為正模式。碰撞能量：15V，細胞加速電壓：3V，檢測方式為多重反應監(jiān)測（MRM）方法。

1.2.4殘留溶劑的檢查

根據CA4s的合成和精制工藝，確定本品殘留溶劑為乙醇（bp.78.4℃）。參照ChP.2015通則0521氣相色譜法和通則0861殘留溶劑測定法，建立氣相色譜法檢測CA4s中的殘留乙醇并進行方法學驗證。

1）色譜條件的選擇

本文對色譜柱SE-54（30m×0.32mm，0.25μm）、OV-624（30m×0.53mm，0.5μm）、OV-17（15m×0.53mm，1.0μm）、PEG（30m×0.53mm，1μm）；分流比（200：30、200：25、200：20、200：20、200：15、200：10、200：5）；流量3.5，4.0，4.5mL/min和柱溫60，80，100，120℃、進樣方式（直接進樣、頂空進樣）以及溶劑（DMF、DMSO）等條件做了篩選，以乙醇的理論塔板數、分離度、拖尾因子為指標進行考察。

2）線性與靈敏度

CA4s中殘留乙醇約0.1%，因此設置線性范圍為0.0067-1.0796mg/mL，進樣濃度為0.0067，0.0135，0.0270，0.0540，0.1080，0.2699，0.5398，1.0796mg/mL。頂空后，依次精密量取上述溶液1mL分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。按信噪比法，在S/N≥10，確定定量限，在S/N≥3，確定檢出限。

3）回收率

供試品溶液的配制：分別精密取本品9份（每份約1g）置于10mL容量瓶中，分為高、中、低3組。往低濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mL的對照品溶液0.8mL；往中濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mL對照品溶液1mL；往高濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mt的對照品溶液1.2mL，加入DMSO稀釋至刻度，分別作為CA4s回收率80%、100%、120%的供試品溶液。

1.2.5含量測定研究

根據CA4s結構（見圖2）中的羧基呈酸性的特點，試驗將采用酸堿滴定法就其含量進行測定。由于CA4s水溶性極差，所以，在設計本品含量測定方法時，采用了以定量過量NaOH溶液溶解，然后用硫酸標準溶液滴定的剩余滴定法來實現。

1）滴定曲線的測定及指示劑的選擇

取樣品約100mg，精密稱定，加入0.1mol/LnaOH滴定液25mL，搖勻溶解后加入50mL新沸水，用0.05mol/Lh2SO4滴定液滴定至溶液中有沉淀析出，并在滴定過程中，記錄滴定過程的pH值變化，繪制滴定曲線。

2）精密度試驗

重復性精密度：取同一批CA4s 6份，經含量測定，以CA4s的含量計算重復性精密度：中間精密度試驗：取本品，分別由兩個不同的實驗員連續(xù)6d、每人測定6份樣品含量，計算含量平均值和RSD。

2結果與討論

2.1結構確認

如圖3所示，MS的分子離子峰（+m/z）為359，碎片峰與CA4s的分子量360的M-1吻合：NMR tH譜（圖4）的氫譜的歸屬分別為：63.296（d，3H，4"--OCH3），δ3.753（d，9H，3，4，5-OCH3），δ6.484（s，2H，2，6'-H），δ6.545（s，1H，2"-H），δ6.676（d，1H，5"-H），δ6.788（d，1H，6"-H），δ7.707（s，1H，3-H），除兩個活潑氫被D2O氘代，其他皆與結構吻合（具體編號見圖2）；IR光譜（圖5）中波數3300，2900，1670，1600，1400cm^-1等分別表現出結構中的羥基、甲基、羰基、甲氧基等，與CA4s分子結構中的相關基團吻合；UV光譜（圖6）特征表明，本品具有共軛體系，受羧基和酚羥基的影響，B帶和E帶都發(fā)生長移現象，最大吸收為311nm，與CA4s的機構特征吻合。4大譜結果表明本品的結構為2-（3，4，5-三甲氧基-苯基）-3-（3-甲氧基2-羥基-苯基）丙烯酸。對比本品順反式UV譜（圖7）可知，由于羥基苯基在空間上影響到羧基的作用，使得311nm的最大吸收萎縮，并250nm的肩峰凸顯，由此證明本品系羧基與羥苯基于異側的反式或E式結構。即（E）2-（3，4，5'-三甲氧基-苯基）-3-（3”-甲氧基2"-羥基-苯基）丙烯酸。

2.2理化性質

試驗結果表明，本品為淺黃色結晶性粉末；在高溫和高濕條件下較穩(wěn)定，光照時出現顏色加深。難溶于水，微溶于甲醇和丙酮，易溶于乙醇，是其難以以原型發(fā)揮活性的根源，飽和水溶液的pH為6.48，在酸性條件較穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定。

2.3有關物質研究

2.3.1色譜分離的影響因素

如圖8所示，水相的pH對分離呈負相關，pH升高保留時間縮短：水相比例提高保留時間增加；柱溫對本品色譜行為無明顯影響。

2.3.2有關物質的鑒定

結合CA4s的合成途徑，起始原料3，4，5-三甲氧基苯乙酸和異香草醛的色譜定位，以及LC/MS對本品雜質譜的分離和在線鑒定，分離出6個雜質組分，其中本品主峰前的雜質2為異香草醛、雜質5為3，4，5-三甲氧基苯乙酸。而雜質6與主峰分子質量相同，但保留時間相差甚遠，結合紫外吸收圖譜和核磁共振氫譜分析，確定雜質6為CA4s的順式（Z式）異構體，結構如圖9所示。

2.3.3檢出限和定量限

按信噪比法，在S/N≥10和S/N≥3，確定CA4s的定量限為1ng、檢出限為0.2ng。

2.3.4專屬性試驗

結果表明，酸破壞（4mol/LhCl破壞4h）和堿破壞（4mol/LnaOH破壞4h）條件下，供試品溶液雜質峰數量無明顯增加，主峰也無明顯降解；在氧化破壞（30%H2O2破壞4h）和高溫破壞（160℃放置1h）條件下，雜質峰含量略有增加，主峰無明顯降解。在光照破壞（4500Lx破壞4h）條件下，雜質峰數量和含量都有增加，雜質6含量增加尤為明顯，主峰也顯著降解。

2.3.5精密度

連續(xù)進樣6針，各雜質峰面積RSD在2.27%～5.03%，表明此方法進樣精密度良好。平行配制6份供試品溶液進樣，以不加校正因子的自身稀釋對照法計算各雜質含量，RSD在1.63%-4.67%之間，表明此方法重復性良好。連續(xù)3d，每天由兩名實驗員平行配制6份供試品溶液進樣，以不加校正因子的自身稀釋對照法計算各雜質含量，RSD在2.84%～5.07%，表明此方法中間精密度良好。

2.3.6有關物質的含量檢查

用建立的方法對自制3批樣品進行有關物質檢查，3批樣品中單個雜質含量均小于0.05%，總雜質含量小于0.5%，符合規(guī)定。

2.3.7有關物質研究小結

由于CA4s在水中幾乎不溶，采用甲醇作為溶劑時，各雜質峰有關物質峰理論塔板數均較低，對稱性差，且溶劑峰對保留時間短的雜質出峰影響很大。故采用甲醇溶解樣品制成高濃度的儲備液（約為5mg/mL），再用流動相作為溶劑，稀釋制成0.5mg/mL的供試品溶液，采用這種方法制備的供試品溶液色譜圖中，各雜質峰柱效有了顯著提高。通過專屬性試驗可以看出，CA4s對酸性、堿性、氧化、高溫條件耐受性較高，在光照的條件下容易發(fā)生構型反轉，得到順式結構的雜質6。因此在合成和儲存過程中，應注意避光。

2.4殘留溶劑

2.4.1色譜條件影響

與其他3種類型色譜柱相比較時，PEG毛細管色譜柱在柱效、分離度和峰對際性方面均有明顯優(yōu)勢，并且分析時間合適；分流比對本品分析影響較大，隨著分流比增大，出峰時間延遲，乙醇峰理論塔板數升高，與基質中的雜質峰分離度有所提高，但靈敏度有所下降，當分流比10：1時，既能保證乙醇峰有較高的柱效、分離度和對稱性，保留時間也比較合適，故選擇分流比10：1；不同流量對本品分析影響不大，流量4.0mL/min時，有較好的柱效、分離度、對稱性，能保證殘留溶劑乙醇的有效檢出，故選擇流量4.0mL/min；柱溫對柱效和拖尾因子影響不大，但隨著柱溫的升高，乙醇峰的分離度顯著下降，柱溫80℃時，能保證殘留溶劑乙醇的有效檢出，且與空白溶劑中相關峰達到有效分離，故照國家藥品標準，選擇柱溫80℃：頂空進樣與直接進樣相比，柱效和峰對稱性等方面均有明顯優(yōu)勢，頂空進樣可避免基質影響和樣品對色譜柱的污染，故選擇頂空進樣方式；溶劑DMF在乙醇峰前面有溶劑峰，影響乙醇的檢出，故選擇DMSO作為殘留溶劑檢查的樣品溶劑。

2.4.2系統(tǒng)適應性條件

色譜柱為PEG毛細管色譜柱（30m×0.53mm，1μm），柱溫80℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度250℃：進樣口溫度200℃；載氣為氮氣，流量為4.0mL/min，分流比10：1；頂空進樣，頂空瓶溫度80℃，平衡時間40min進樣：進樣體積1.0mL。

2.4.3線性與靈敏度

由乙醇峰高（H）對乙醇溶液濃度回歸作圖，獲得乙醇的標準曲線方程為y=674724.8172x-2034.2，（r²=0.9993）。乙醇濃度在0.0067-1.0796mg/mL范圍內，其線性關系良好。按信噪比法，在S/N≥10，確定定量限1.8μg/mL；在S/N≥3，確定檢出限為0.6μg/mL。

2.4.4回收率與精密度

經過高、中、低3種濃度的回收率測定結果分別為98.06%（RSD為4.57%）、103.6%（RSD為1.73%）、93.63%（RSD為7.21%）：進樣精密度RSD為1.90%；重復性精密度測定殘留溶劑含量為0.0739%（RSD為4.10%）。方法的準確度和精密度均良好。

2.4.53批樣品的殘留溶劑結果

用建立的方法對自制3批樣品進行殘留溶劑檢查，3批樣品中殘留溶劑含量為0.0748%、0.0727%、0.0795%，符合規(guī)定。

2.5含量測定

2.5.1滴定曲線的考察

滴定曲線確定突躍范圍為7.5～9.0，由于本品為難溶于水的酸性化合物，故實驗設計本品預先溶于定量的NaOH溶液中，由HCl標準溶液回滴定剩余的堿液，經空白校正后，計算出本品的含量。根據溶液體系由堿到酸的滴定過程，試驗選擇了堿性指示劑酚酞指示終點，溶液由紅色變?yōu)闊o色。

2.5.2CA4s的含量測定方法

取樣品約300mg，精密稱定，加入0.1mol/LnaOH滴定液25mL，充分搖勻溶解后加入50mL新沸水，加入酚酞指示劑2滴，用0.05mol/Lh2SO4滴定液滴定至溶液紅色消失，且0.5min內顏色無改變，并將結果用空白試驗校正。每1mLh2SO4（0.05mol/L）滴定液相當于36.04mgc19H20O7。

2.5.3精密度試驗

重復性精密度測定結果為100.7%（RSD 0.08%）：中間精密度測定結果為100.5%（RSD 0.11%），說明此方法精密度良好。

2.5.4 3批樣品含量測定

用建立的方法對自制3批樣品含量進行測定，3批樣品含量分別為100.4%（RSD 0.057%）、100.6%（RSD 0.150%）、100.6%（RSD 0.057%）。

2.5.5容量法研究小結

采用酚酞作為指示劑時，溶液濃度對重點判斷影響很大，濃度越大變色現象越不明顯，經過多次對比試驗，在堿溶液中加入50mL新沸水對溶液進行稀釋后，能顯著觀察到變色現象，有利于減少終點誤差。

3結束語

CA4s作為Combretastatin類化合物重要中間體，其質量將對終產物造成直接影響。本品的化學結構鑒定結果表明與CA4s的結構式吻合：所建立的HPLC雜質檢查法、GC殘留溶劑檢查法和容量分析法能夠有效檢測出本品的有關物質、殘留溶劑和含量，可為進一步研究CA4s提供良好的分析手段。