11種植物提取物對4種病原細(xì)菌的抑菌活性篩選

謝娜 李超 馮俊濤 張興

摘 要 采用瓊脂擴(kuò)散法初步測試11種植物提取物對魔芋軟腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）、獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、白菜軟腐病菌（Erwinia carotorora）、核桃細(xì)菌性黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv.juglandis）4種病原細(xì)菌的抑制活性，進(jìn)一步采用二倍稀釋法測定高抑菌活性物質(zhì)的最低抑菌濃度（MIC），旨在為植物源殺細(xì)菌劑的研發(fā)提供線索。測定結(jié)果表明，1 000 μg/mL劑量下，大黃、博落回和狼毒提取物對魔芋軟腐病菌具有較強(qiáng)抑制活性，對獼猴桃潰瘍病菌抑制作用最好的是博落回和大黃提取物，對核桃黑斑抑菌效果最好的是蛇床提取物，均優(yōu)于或相當(dāng)于農(nóng)用鏈霉素200 μg/mL的效果；二倍稀釋法測試表明，大黃和博落回提取物對魔芋軟腐病菌的MIC值分別為7.8、15.6 μg/mL；大黃和博落回提取物對獼猴桃潰瘍病菌的MIC值分別為3.9、15.6 μg/mL。說明大黃、博落回和狼毒提取物均具有顯著抑制植物病原細(xì)菌的活性，有開發(fā)為新型植物源殺細(xì)菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞 植物病原細(xì)菌；活性篩選；大黃素；血根堿；狼毒素

中圖分類號 S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Screening of Antibacterial Activities of 11 Plant Extracts Against Four Pathogenic Bacteria

XIE Na1， LI Chao1， FENG Juntao1，2*， ZHANG Xing1，2

1 Research and Development Center of Biorational Pesticides， Northwest A & F University， Yangling， Shaanxi 712100， China

2 Engineering and Research Center of Biological Pesticide of Shaanxi Province， Yangling， Shaanxi 712100， China

Abstract The study measured the antibacterial activity of 11 plant extracts on four bacterial pathogens like Erwinia carotovora pv. carotovora， Pseudomonas syringae pv. actinidiae， Erwinia carotorora， and Xanthomonas campestris pv.juglandis to provide clues for the development of new bactericides by agar diffusion method. Double broth dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration （MIC）. The results obtained by the agar diffusion method showed that the extracts of sanguinarine， emodin and chamaejasmine had a relatively good inhibitory effect on E. carotovora pv. carotovora， and the extracts of emodin and chamaejasmine revealed a notable inhibitory effect on P. syringae pv. actinidiae， and the osthole extract could inhibit X. campestris pv. juglandis effectively， at the concentration of 1 000 μg/mL， and the effect was superior or comparable to streptomycin at 200 μg/mL. Results of the determination of MIC displayed that MIC value of the extract of emodin and sanguinarine on E. carotovora pv. carotovora was 7.8 μg/mL and 15.6 μg/mL. The MIC value of the extract of emodin and chamaejasmine on P. syringae pv. actinidiae was 3.9 μg/mL and 15.6 μg/mL. The extracts of sanguinarine， emodin and chamaejasmine had an apparent antibacterial activity， which could be developed as new botanical bactericides.

Key words plant pathogenic bacteria； screening； emodin； sanguinarine； chamaejasmine

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.019

植物源殺菌劑具有選擇性高、環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全、低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，從植物中尋找抑菌活性物質(zhì)， 是研發(fā)新型殺菌劑的熱點(diǎn)之一。目前，中國開發(fā)與應(yīng)用的植物源殺菌劑主要有苦參堿、黃岑苷、小檗堿、丁子香酚、香芹酚、兒茶素、大蒜素、乙蒜素、大黃素甲醚等[1-3]。但前述產(chǎn)品多集中于對植物真菌病害的防治，對植物源殺細(xì)菌劑的研究大多側(cè)重于食品污染菌的控制，且大多數(shù)還處于室內(nèi)篩選階段。魏希穎等[4]研究發(fā)現(xiàn)泡桐花提取液對金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制作用。葉舟[5]測定了木麻黃（Casuarina equisetifolia Forst）小枝提取液的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。崔彥等[6]的研究證明五倍子、丁香、地榆對黃瓜細(xì)菌角斑病菌表現(xiàn)出顯著的抑制作用，其中五倍子提取物的活體防效可達(dá)60%，具有一定的開發(fā)潛力。李玉玲[7]發(fā)現(xiàn)竹焦油對甘藍(lán)黑腐病菌、番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、茄青枯病菌等多種供試細(xì)菌都有不同程度的抑制活性。為了獲得對植物細(xì)菌病害有廣泛抑菌譜的植物源物質(zhì)，本研究選取已報道過的具有廣泛抑菌活性的11種植物提取物，對魔芋軟腐病菌、獼猴桃潰瘍病菌、核桃黑斑病菌、白菜軟腐病菌4種常見的病原細(xì)菌進(jìn)行室內(nèi)抑菌活性篩選，旨在為新型植物源殺細(xì)菌劑的開發(fā)研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 魔芋軟腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）、獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、白菜軟腐病菌（Erwinia carotorora）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供；核桃細(xì)菌性黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv. juglandis）由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院提供。

1.1.2 供試植物源物質(zhì)及試劑 大黃提取物（其中大黃素含量為0.30%）、博落回提取物（其中血根堿含量為0.57%）、狼毒提取物（其中狼毒素含量為1.90%）、皂莢提取物（其中皂莢素含量為6.90%）、苦參提取物（其中苦參堿含量為2.15%）均由山西德威生化有限公司提供。90%的小檗堿、蛇床提取物（其中蛇床子素的含量為10%）、藜蘆生物堿（其中藜蘆胺含量為2.30%）、98%的肉桂酸、98%的丁香酚、98%的檸檬酸銅均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。72%的農(nóng)用鏈霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。丙酮、葡萄糖、瓊脂粉、氯化納、胰蛋白胨、酒精、牛肉膏、酵母粉均購于陜西天成化玻有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制方法 室內(nèi)生測用于細(xì)菌性病原菌的培養(yǎng)與保存的固體培養(yǎng)基（NA）：稱取瓊脂粉15 g、

蛋白胨5 g、牛肉膏3 g，加水至1 L，滅菌鍋滅菌待用；用于活化細(xì)菌性病原菌菌株的液體培養(yǎng)液（LB）：稱取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉3 g，加水至1 L，滅菌鍋滅菌待用。

1.2.2 藥劑配制 采用對供試病菌沒有抑菌作用的丙酮作為溶劑，將供試植物源物質(zhì)溶解。用20%丙酮-水溶液將各植物源提取物或化合物按其有效成分含量溶解稀釋成2 000 μg/mL藥液（作為母液備用）。用無菌水將各母液分別依次2倍稀釋最終確定為1 000、500、250 、125、62.5 μg/mL 5個濃度梯度處理，均以濃度為200 μg/mL的72%農(nóng)用鏈霉素作藥劑對照，采用對供試細(xì)菌沒有抑菌作用的20%丙酮-水溶液作為空白對照，每個處理重復(fù)3次，以減少誤差。

1.2.3 供試菌種的準(zhǔn)備 將供試菌種在試驗前1 d轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，置于28 ℃恒溫?fù)u床箱中活化12 h。用無菌水調(diào)配成菌液濃度為1×106 CFU/mL，以供室內(nèi)抑菌活性篩選使用。

1.2.4 瓊脂擴(kuò)散法室內(nèi)抑菌活性篩選方法 采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行室內(nèi)抑菌活性篩選[8]，將溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃，加入活化好的細(xì)菌數(shù)量大于106 CFU/mL的供試菌懸液搖勻（成帶菌培養(yǎng)基）。每次取15 mL的帶菌培養(yǎng)基，分別倒入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，制成帶菌平板。待冷卻后用直徑為9 mm的打孔器在平板上均勻打3個孔，并用接種針挑出孔中培養(yǎng)基，在每孔內(nèi)加入75 μL配好的供試植物源物質(zhì)，以200 μg/mL的農(nóng)用鏈霉素作為藥劑對照，并以丙酮作為溶劑對照，每組處理重復(fù)3次。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，用直尺按十字交叉法測量抑菌圈直徑（減去孔徑9 mm）求取平均值，進(jìn)行比較。

1.2.5 最低有效抑制濃度（MIC）的測定方法 采用二倍稀釋法測定待測植物源物質(zhì)的MIC值[9]，取編號為1～11的試管以及適量的蒸餾水，放入滅菌鍋里滅菌待用。滅菌完成后，取無菌試管，分別往試管內(nèi)加入2 mL無菌水。將2 mL濃度為2 000 μg/mL待測藥液加入1號試管中，搖勻后，將混合后的藥液2 mL加入2號試管中，依次操作到10號管為止，棄掉10號管中的2 mL藥液，使各個試管中的藥液體積一樣，將11號管設(shè)為空白對照，加入同等含量丙酮的水溶液。每種病菌設(shè)3組重復(fù)處理。最后將稀釋好的細(xì)菌數(shù)量達(dá)104 CFU/mL的病原菌菌懸液2 mL分別加入1～11號試管中，置于適宜的溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待空白對照試管菌液出現(xiàn)渾濁，觀察結(jié)果，進(jìn)行比較。結(jié)果判斷：由于菌液與藥液等量混合，相當(dāng)于將藥液二倍稀釋，最終待測藥液為10個濃度梯度，分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6 、7.8、3.9、1.8、0.9 μg/mL。

結(jié)果觀察：通過肉眼比對發(fā)現(xiàn)試管內(nèi)液體澄清透明經(jīng)震蕩后仍無沉淀產(chǎn)生，則此試管對應(yīng)的藥液濃度即為此藥劑對待測病菌的MIC值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 11種植物提取物對4種病原細(xì)菌的室內(nèi)抑菌活性篩選

2.1.1 魔芋軟腐病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選 采用瓊脂擴(kuò)散法測定了11種植物提取物對魔芋軟腐病菌的抑制活性，結(jié)果表明，供試11種植物提取物對魔芋軟腐病菌的抑制效果有明顯的差異。大黃、狼毒、博落回提取物、小檗堿、肉桂酸和藜蘆生物堿6種植物提取物對魔芋軟腐病菌均有不同程度的抑制作用（表1），皂莢、苦參、蛇床提取物及丁香酚、檸檬酸銅對魔芋軟腐病菌則無明顯抑制效果。由表1可看出，博落回提取物對魔芋軟腐病菌的抑制作用最強(qiáng)，濃度在1 000 μg/mL時，抑菌圈直徑最高達(dá)（19.3±0.30） mm；其次是大黃、狼毒提取物，抑菌圈直徑分別為（17.3±0.48）、（11.9±0.26） mm，均高于或相當(dāng)于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素200 μg/mL的抑菌圈直徑（12.6±0.26） mm；同時，小檗堿、藜蘆生物堿的抑菌圈直徑也達(dá)到了（10.0±0.26）、（10.1±0.34） mm，對魔芋軟腐病抑制作用較好；肉桂酸僅有微弱抑菌活性，其1 000 ?g/mL處理抑菌直徑僅（0.3±0.10） mm。

2.1.2 獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選 通過對獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)活性篩選結(jié)果表明（表2），在濃度為1 000 μg/mL時，大黃和狼毒提取物抑菌圈直徑分別為（13.3±0.47）、（12.2±0.32） mm，均大于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素濃度在200 μg/mL時的抑菌圈直徑（12.0±0.18） mm；博落回、皂莢、苦參、蛇床提取物對病原菌抑制作用次之，最大抑菌圈直徑在6.7～9.8 mm之間；檸檬酸銅的最大抑菌圈直徑為（0.2±0.00） mm，抑菌作用較弱；小檗堿、丁香酚、肉桂酸以及藜蘆生物堿則無明顯抑制效果，故在表2中未列出。

2.1.3 核桃黑斑病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選 從表3結(jié)果可看出，蛇床子提取物對核桃黑斑病菌的抑菌作用最好，在濃度為1 000 ?g/mL時，抑菌直徑達(dá)到（12.7±0.13）mm，其次是苦參提取物，抑菌圈直徑為（10.0±0.23）mm。皂莢提取物、丁香酚、肉桂酸對核桃黑斑病菌也有一定的抑制作用。大黃、博落回、狼毒提取物、小檗堿、檸檬酸銅以及藜蘆生物堿對核桃黑斑病菌無抑制作用，在表3中未列出。而藥劑對照鏈霉素在200 ?g/mL時抑菌圈直徑達(dá)（17.0±0.58）mm。由此表明，這11種植物提取物對核桃黑斑病菌抑制作用不顯著。

2.1.4 白菜軟腐病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選 試驗結(jié)果（表4）表明，在11種供試植物提取物中，僅苦參提取物、丁香酚和肉桂酸對白菜軟腐病菌有抑菌作用，而大黃、博落回、狼毒、蛇床子提取物、小檗堿、檸檬酸銅、藜蘆生物堿及皂莢提取物對白菜軟腐病菌無明顯抑制作用，在表4的抑菌活性篩選的結(jié)果中未列出；苦參提取物、丁香酚和肉桂酸對白菜軟腐菌均有一定的抑制作用但不顯著，其最大的抑菌圈直徑均比對照藥劑農(nóng)用鏈霉素在200 ?g/mL時的抑菌圈直徑小。

2.2 抑菌活性較好的植物源物質(zhì)的MIC測定結(jié)果

2.2.1 5種植物提取物對魔芋軟腐病菌的MIC測定結(jié)果 由表5可知，大黃和博落回提取物對魔芋軟腐病菌的MIC值分別為7.8、15.6 ?g/mL，均顯著低于對照農(nóng)用鏈霉素的MIC值31.3 ?g/mL。狼毒提取物、小檗堿和藜蘆生物堿的MIC值分別為125、62.5、250 ?g/mL，表現(xiàn)出一定的抑菌活性，與表1的抑菌圈試驗結(jié)果基本一致。綜合表1和表5可知，大黃和博落回提取物對魔芋軟腐病菌的抑菌作用最為顯著，有進(jìn)一步研究的潛力。同等含量丙酮的水溶液對魔芋軟腐病菌的MIC值無影響。

2.2.2 6種植物提取物對獼猴桃潰瘍病菌的MIC測定結(jié)果 從表6可知，大黃提取物對獼猴桃潰瘍病菌的MIC值與對照農(nóng)用鏈霉素均為3.9 ?g/mL，表明獼猴桃潰瘍病菌對大黃提取物比較敏感。其次苦參和狼毒提取物的MIC值均達(dá)到15.6 ?g/mL，皂莢和博落回提取物分別為31.3、 250 ?g/mL，與表3的抑菌活性篩選結(jié)果基本相同。結(jié)合表5～6可看出，大黃、博落回和狼毒提取物對魔芋軟腐病菌和獼猴桃潰瘍病菌均有顯著的抑制作用，表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液對獼猴桃潰瘍病菌的MIC值無影響。

2.2.3 3種植物提取物對核桃黑斑病菌的MIC測定結(jié)果 由表7可見，核桃黑斑病菌對農(nóng)用鏈霉素最敏感，其MIC值為7.8 ?g/mL。皂莢、苦參和蛇床子、提取物的MIC值分別為15.6、31.3、15.6 ?g/mL，也表現(xiàn)出較好的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液對核桃黑斑病菌的MIC值無影響。

3 討論

本研究采用瓊脂擴(kuò)散法、二倍稀釋法對11種植物提取物對魔芋軟腐病菌、獼猴桃潰瘍病菌、白菜軟腐病菌、核桃細(xì)菌性黑斑病菌4種病原細(xì)菌的抑菌活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明大黃、博落回和狼毒提取物均具有顯著抑制植物病原細(xì)菌的活性，有開發(fā)為新型植物源殺細(xì)菌劑的潛力。其中，大黃提取物對魔芋軟腐病菌和獼猴桃潰瘍病菌的抑制效果最為突出；博落回提取物對魔芋軟腐病菌、狼毒提取物對獼猴桃潰瘍病菌、蛇床提取物對核桃黑斑病菌的MIC均在20 ?g/mL以下，與相應(yīng)的對照藥劑農(nóng)用鏈霉素的MIC值相當(dāng)，有顯著的抑菌活性?？鄥?、蛇床子和皂莢提取物對特定病菌有良好的抑制活性，在殺細(xì)菌應(yīng)用上有研究的價值。

狼毒、大黃和博落回提取物在抗細(xì)菌作用方面的研究甚少，且多集中于醫(yī)藥、食品研究。前人的=研究表明，狼毒石油醚提取物的殺煙蚜活性最好[10]；瑞香狼毒提取物對小菜蛾、枸杞蚜蟲有十分顯著的毒殺活性[11-12]。南蘋瑤等[13]發(fā)現(xiàn)大黃乙醇提取物對大腸埃希菌ATCC25922的體外抑菌作用明顯。Hazni等[14]研究結(jié)果顯示，大黃素對金黃色葡萄球菌、溶血溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等都有較強(qiáng)的抑制作用；李文娟[15]研究證明瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最顯著，其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度為0.63 mg/mL；郁建平[16-17]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸血根堿具有很強(qiáng)的廣譜抑菌作用，對木霉、根霉、黃曲霉、黑曲霉、米曲霉、毛霉、酵母的最低抑菌濃度均低于40 ?g/mL。楊軍輝等[18]發(fā)現(xiàn)牛角瓜根的石油醚粗提物對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌和大腸埃希氏菌都表現(xiàn)出良好的抑菌活性。由此可見，狼毒、大黃和博落回提取物對多種細(xì)菌、真菌及農(nóng)業(yè)害蟲均具滅殺效果，尤其是其在農(nóng)業(yè)方面的抗植物病原細(xì)菌作用更值得進(jìn)一步深入研究。

供試11種植物源物質(zhì)對白菜軟腐病菌的抑制作用都不顯著，應(yīng)該適當(dāng)增大篩選范圍，以期得到對白菜軟腐病菌有良好抑制作用的植物源物質(zhì)。另外，本研究篩選得到的大黃、博落回和狼毒提取物等為植物粗提物，且僅進(jìn)行了室內(nèi)離體測試，而未進(jìn)行活體試驗以及田間試驗，因而其主要抑菌活性成分及其在活體植物上的殺細(xì)菌活性均有待于進(jìn)一步研究和探討。

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