橡膠樹回枯病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性測定

胡文軍 李增平 吳如慧 丁婧鈺 張宇 藍(lán)志南

摘 要 對(duì)海南萬寧新中農(nóng)場7-33-97橡膠幼樹上發(fā)生的回枯病進(jìn)行病原菌鑒定、致病性及生物學(xué)特性測定。結(jié)果表明：橡膠幼樹回枯病病原菌為可可毛色二孢[Lasiodiplodia theobromae （Pat.）Criff.et Maubl.]。生物學(xué)特性測定結(jié)果顯示，病菌最適生長條件為溫度30 ℃，pH值為4，碳源為葡萄糖，氮源為大豆蛋白胨；且不同光照條件對(duì)菌絲生長影響不明顯。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；可可毛色二孢；回枯??；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Identification and Biological Characteristics of Pathogen Causing Diebark on Rubber Trees

HU Wenjun1， LI Zengping1*， WU Ruhui1， DING Jingyu1， ZHANG Yu1， LAN Zhinan2

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， HainanUniversity， Haikou， Hainan 570228， China

2 Hainan Rubber Industry Group Co.， Ltd.， Xinzhong Branches， Wanning， Hainan 571536， China

Abstract Pathogen identification， pathogenicity and biological characteristics were carried out on dieback occurring on young rubber trees of 7-33-97 in Xinzhong Farm， Wanning， Hainan were reported in this study. The results of morphological characteristics of the pathogen and identification of molecular biology techniques showed that the pathogen was Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff.et Maub. The results of biological characteristics test showed that 30 ℃， pH 4， glucose as carbon source and soybean peptone as nitrogen source were the optimum conditions for the pathogen growth. Different light conditions had little effect on the growth rate of the pathogen hypha.

Key words rubber trees； Lasiodiplodia theobromae； dieback； biological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.016

2017年7月，在海南萬寧新中農(nóng)場2～4年生的7-33-97橡膠幼樹上發(fā)生較為嚴(yán)重的一種新病害，發(fā)病面積約為266.6 hm2，發(fā)病率為1.9%～50%，枯死率為0.4%～40%，發(fā)病幼樹自頂端枝條開始向下回枯，枝干流膠，最后整株枯死，枯死幼樹的木質(zhì)部發(fā)生藍(lán)變，取名為橡膠樹回枯病。國內(nèi)外已報(bào)道的引起林木枝干流膠、回枯和木質(zhì)部藍(lán)變的病原菌有多種，如Ang Boon Beng[1]首次報(bào)道了在馬來西亞由可可球二孢菌（Botrydiplodia theobromae Pat.）引起的可可突發(fā)性回枯??；肖倩莼等[2-3]報(bào)道色二孢菌（Diplodia natalensis）和炭疽菌（Colletotrichum gloesporiodes）可引起芒果樹的回枯病和流膠?。悔w桂華等[4]從橡膠木中分離到引起木材藍(lán)變的真菌主要為Lasiodiplodia theobromae和Ceratocystis spp.；Encinas等[5]從白楊和橡膠樹中分離到引起木材藍(lán)變的真菌Lasiodiplodia theobromae；Cardoso等[6]首次報(bào)道了在巴西由Lasiodiplodia theobromae引起的腰果枝條回枯?。悔w桂華[7]報(bào)道了引起馬尾松木材藍(lán)變的2種長喙殼屬真菌，分別為松生長喙殼（Ceratocystis pinicola）和木生長喙殼（C. lignicola）；鄭曉慧等[8]報(bào)道甘薯長喙殼（Ceratocystis fimbriata）可引起四川省攀西地區(qū)的石榴枯萎病，病樹木質(zhì)部變色，葉片變黃和萎蔫，后期全部凋落，枝條枯萎后整樹枯死。由于引起樹木枝枯、流膠、木質(zhì)部變色的病原菌較為復(fù)雜，本研究對(duì)發(fā)現(xiàn)的橡膠樹回枯病這一新病害進(jìn)行病原鑒定和生物學(xué)特性測定，以期為生產(chǎn)防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣本 采自海南萬寧新中農(nóng)場和瓊中加釵農(nóng)場2～4年生的7-33-97和PR107發(fā)病橡膠幼樹莖干和枝條，將發(fā)病的莖干和枝條鋸下，裝入封口袋中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、PD液體培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基和木屑培養(yǎng)基，其中PDA培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基配方參考方中達(dá)[9]的《植病研究方法》，木屑培養(yǎng)基參考高秀兵等[10]的方法。

1.1.3 試劑 主要有通用引物ITS1和ITS4，特異性引物Bt2a/Bt2b[11]、EF1-728F/EF1-986R[12]和Bth-S/Bth-A[13]，OMEGA Fungal DNA Kit等。

1.1.4 接種苗木 供致病性測定的苗木為海南大學(xué)教學(xué)基地內(nèi)種植的2年生7-33-97橡膠樹袋裝苗，2年生和4年生的橡膠實(shí)生苗，市場購買的番薯塊莖和芒果果實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 采用組織分離法和單孢分離法純化出菌株備用。組織分離法是將病莖表面噴上70%的酒精進(jìn)行表面消毒，使用已消毒的砍刀沿發(fā)病處將病莖劈開，在超凈工作臺(tái)上用滅菌后的手術(shù)刀從發(fā)病莖干中心處切取約6 mm大小的變色木質(zhì)部組織塊，放入含有利福平的PDA平板培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)1 d后，從組織塊上長出的菌落邊緣挑取5 mm×5 mm的菌絲塊，接種至空白的PDA培養(yǎng)基中純化，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。單孢分離法是用滅菌接種環(huán)從病莖表皮上長出的黑色孢子堆上挑取少量分生孢子，置于1 mL滅菌水中混勻后進(jìn)行梯度稀釋成不同濃度的孢子懸浮液，然后用滅菌的玻璃涂棒分別粘取不同稀釋度的孢子懸浮液，涂布在PDA平板培養(yǎng)基表面，于28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，最后挑取單孢菌落進(jìn)行純化備用。

1.2.2 致病性測定 （1）菌絲塊接種：選取5株齡期為2年生的7-33-97健康橡膠樹袋裝苗，2株進(jìn)行劃傷接種，2株無傷接種，1株接空白PDA培養(yǎng)基作對(duì)照。先在待接種植株的上部莖干表面噴70%酒精進(jìn)行表面消毒，待酒精風(fēng)干后，用滅菌手術(shù)刀在消毒的植株莖干表面間隔5 cm左右刮出長約1 cm的2個(gè)傷口，用滅菌接種環(huán)挑取分離純化的菌絲塊，菌絲面朝下接種在傷口上，蓋上濕棉花后用塑料帶包裹保濕，無傷接種則不制造傷口，其余與創(chuàng)傷接種相同。接種后每2 d一次，定期觀察發(fā)病情況并拍照記錄。

以同樣的方法利用菌絲塊接種3株2年生的橡膠樹實(shí)生苗基部莖干，1株接空白PDA培養(yǎng)基作對(duì)照，包裹保濕且定期觀察。

將2個(gè)番薯塊莖表面噴70%酒精進(jìn)行消毒后，對(duì)半切開，間隔2 cm，一半接3塊菌絲塊，一半接空白PDA培養(yǎng)基作對(duì)照，用濕棉花保濕且定期觀察。

將2個(gè)芒果表面噴70%酒精消毒后，間隔2 cm用滅菌束針刺破4處表皮，中央最頂端接空白PDA培養(yǎng)基作對(duì)照，兩側(cè)3處傷口接菌絲塊，用濕棉花保濕且每天觀察。

（2）病組織接種：選2株4年生橡膠苗，在基部老化莖干表面噴70%酒精消毒后，間隔5 cm左右鉆3個(gè)直徑0.8 cm的小洞，深入木質(zhì)部，接入從病株莖干上削下的變色病木組織，1株接健康木質(zhì)組織作對(duì)照，保濕包裹且定期觀察。

1.2.3 子實(shí)體誘導(dǎo) 挑取分離純化的菌絲塊接種到滅菌的木屑培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)進(jìn)行子實(shí)體誘導(dǎo)[10]。

1.2.4 病原菌鑒定 （1）形態(tài)觀察：在病組織上挑取病原菌子實(shí)體制片，在顯微鏡下觀察；使用Imagine Pro Plus 6.0軟件測量分生孢子器直徑和分生孢子的大小，根據(jù)陸家云[14]《植物病原真菌學(xué)》、戚佩坤[15]《廣東果樹真菌病害志》、胡美姣等[16]參考資料進(jìn)行種類鑒定。

（2）分子生物學(xué)測定：參考彭軍等[17]的方法。在75 mL的PD培養(yǎng)基中放入5塊直徑為5 mm的菌餅，置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后取出；將搖出的菌絲球移至離心管內(nèi)，放入冰箱中冷凍后進(jìn)行研磨，用OMEGA Fungal DNA Kit進(jìn)行DNA提??；將所提取的DNA用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），特異性引物Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）/Bt2b：（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）、EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）和Bth-S（5′-TCTCCCACCCTTTGTGAAC-3′）/Bth-A（5′-AAAAGTTCAGAAGGTTCGT C-3′）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果獲得500～750 bp的明亮條帶，切膠回收進(jìn)行電泳驗(yàn)證后，將膠回收的產(chǎn)物送至華大基因測序，所得測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5 生物學(xué)特性測定 選取單孢純化后菌齡相同的培養(yǎng)菌落，在其邊緣用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅用接種環(huán)分別挑接到不同種類的培養(yǎng)基中進(jìn)行相關(guān)測定。除不同碳、氮源測定時(shí)使用更換等質(zhì)量的不同碳、氮源的Czapek培養(yǎng)基外，其余測定都使用PDA培養(yǎng)基，除不同溫度條件測定外，不同光照條件的測定在30 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，其余處理測定的培養(yǎng)溫度均為28 ℃，每組處理均設(shè)3次重復(fù)。待最優(yōu)條件下菌絲生長到近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，用十字交叉法測量菌落直徑。其中不同測定的設(shè)置為：

（1）光照：設(shè)置連續(xù)光照、光暗交替和連續(xù)黑暗3組處理。

（2）溫度：設(shè)置培養(yǎng)溫度為10、15、20、25、28、30、32、34、37、40 ℃共10組處理。

（3）pH：設(shè)置pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10和11共10組處理。

（4）碳源：設(shè)置碳源為缺碳、麥芽糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、可溶性淀粉、葡萄糖和D-山梨醇共8組處理。

（5）氮源：設(shè)置氮源為缺氮、氯化銨、硫酸銨、大豆蛋白胨、硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鈣、L-天冬酰胺共8組處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹回枯病癥狀

于2017年7～8月間，在海南省萬寧新中農(nóng)場、瓊中加釵農(nóng)場的部分膠園中的橡膠幼樹發(fā)生回枯病，此病主要危害2～4年生的7-33-97和PR107橡膠幼樹。新中農(nóng)場7-33-97品系的發(fā)病面積約為266.6 hm2，發(fā)病率為1.9%～50%，枯死率為0.4%～40%。加釵農(nóng)場PR107品系發(fā)病面積約為66.6 hm2，枯死率最高達(dá)5.8%。發(fā)病幼樹先從樹冠頂端枝條開始，小枝葉片變黃，落葉干枯，內(nèi)部組織變褐，繼而蔓延到主干，沿主干向下擴(kuò)展，有的病株莖干皮層組織呈縱向條帶狀壞死，所有病株木質(zhì)部均發(fā)生藍(lán)變，橫切基部主桿可見木質(zhì)部有沿主干中央向外呈扇形或放射狀擴(kuò)展的藍(lán)色病變，發(fā)病后期整株幼樹枯死，部分病樹莖干表面伴隨有流膠現(xiàn)象，砍下的病莖在室內(nèi)放置20 d后，病菌表皮長出黑褐色子座和分生孢子器，并產(chǎn)生大量黑色分生孢子（圖1）。

2.2 致病性測定

4～10 d后，傷口接種分離菌和病組織的橡膠苗嫩莖和老化莖均被侵染，無傷接菌的則未被侵染，對(duì)照則無明顯變化。菌絲塊接種的橡膠苗嫩莖4 d后傷口變黑擴(kuò)大，木質(zhì)部變軟下折，病健交界處有褐色水漬狀壞死帶，上部葉片仍保持綠色，9 d后，接種病原菌的橡膠苗嫩莖病部組織變干，表面生出大量小黑點(diǎn)（分生孢子器），上部葉片全部變黃后脫落。而菌絲塊接種的橡膠苗老化莖10 d后傷口才變成黑褐色，擴(kuò)展稍慢。病組織接種的橡膠苗老化莖干組織變褐。菌絲塊接種4 d后，番薯塊莖病部組織藍(lán)變，芒果病部呈現(xiàn)黑褐色病斑。切取接菌后發(fā)病的植物病部組織進(jìn)行再分離，重新分離獲得形態(tài)相同的菌株，表明用于接種的分離菌為致病菌（圖2）。

A：地上部枝條回枯，莖干枯死；B：莖干流膠；C：莖干表皮呈縱向條帶狀壞死；D：小枝干枯，內(nèi)部組織變褐；E、F：莖干木質(zhì)部藍(lán)變；G：20 d后在病莖表皮上長出黑色分生孢子堆。

A： The symptom of dieback on branches of rubber trees； B： The gum flowed out from the stem of the rubber tree； C： Stem epidermis was a longitudinal strip necrosis； D： Branchlets dieback and internal tissue browned； E & F： The blue change of xylem in trunk； G： Twenty days later black conidia piles were grown on the epidermis of diseased stems.

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 病原菌在PDA培養(yǎng)基中，菌落呈圓形、白色、輻射生長、絮狀，老化后變?yōu)樗{(lán)黑色至黑色，邊緣整齊（圖3-A）。在木屑培養(yǎng)基中長有黑色且致密菌絲層，約10 d后變黑，表面誘導(dǎo)后長出黑褐色子座，其內(nèi)長有黑色的分生孢子器（圖3-B、C）。病原菌的分生孢子器呈近球形、黑色，大小為（165.98～335.13） μm×（249.30～342.96） μm，平均為252.80 μm×295.52 μm；分生孢子兩型，初期為單胞無色，后期為雙胞褐色，褐色雙胞孢子表面有縱脊，分生孢子大小為（19.66～27.89） μm×（10.23～15.96） μm，平均為24.15 μm×13.01 μm（圖3-D、E）。

A：菌絲塊接種橡膠樹嫩莖組織變褐；B：菌絲塊接種橡膠樹老化莖組織變褐；C：病組織接種橡膠老化莖組織變褐；D：橡膠樹嫩莖發(fā)病后下折；E：接種9 d后的回枯癥狀；F：接種9 d后枯死莖干上長出的病菌分生孢子器；G：菌絲塊接種4 d后的番薯塊莖組織藍(lán)變；H：菌絲塊接種4 d后的芒果表面呈現(xiàn)黑褐色病斑。

A： Myceliums inoculated rubber tree tender stem tissue browning； B： Myceliums inoculated rubber tree older stem tissue browning； C： Diseased tissue inoculated rubber tree tender stem tissue browning； D： Rubber tree tender stem break after the diseased； E：The symptoms of dieback on rubber tree after 9 days of inoculation； F： Pycnidia of pathogen grow on stems of rubber tree after 9 days of inoculation； G： The tuber tissue of sweet potato turned blue after four days of inoculation； H： The surface of the mango inoculated for 4 days showed dark brown spot.

2.3.2 分子生物學(xué)技術(shù)鑒定結(jié)果 經(jīng)測序，病原菌rDNA-ITS序列為506 bp（NCBI登錄號(hào)為MF952885），Bth、Bt2和EF1序列分別為391 bp（NCBI登錄號(hào)為MG271758）、432 bp（NCBI登錄號(hào)為MG000590）和290 bp（NCBI登錄號(hào)為MG000591）（圖4）。與NCBI登錄號(hào)為KY432690.1、MF114110.1、KP698094.1、FJ150695等可可毛色二孢[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]序列的相似度為99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定結(jié)果，將引起橡膠幼樹回枯病的病原菌鑒定為可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]。

2.4 生物學(xué)特性測定

2.4.1 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響 在所設(shè)置的10組不同溫度處理中，病原菌在15～40 ℃的條件下均能生長，適宜生長的溫度為28～34 ℃，最適生長溫度為30 ℃，40 ℃時(shí)生長較慢，在10 ℃時(shí)則不生長（圖5）。

2.4.2 不同光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響 在不同的光照處理中，病原菌的菌落生長勢基本一致，表明不同的光照條件對(duì)菌絲的生長無明顯影響（圖6）。

2.4.3 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響 病原菌在pH 2～10條件下均可生長，適宜生長的pH值為4～6，最適pH值為4，表明病菌喜歡偏酸的環(huán)境（圖7）。

M： Marker； 1： EF1； 2： Bt2； 3： Bth； 4： rDNA-ITS.

不同大寫字母表示0.01水平上的差異極顯著，不同小寫字母表示0.05水平上的差異顯著。下同。

Different capital letters mean extremely significant different at 0.01 level， Different small letters mean significant different at 0.05 level. The same as below.

2.4.4 不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長的影響 不同碳源對(duì)菌絲生長的影響：病原菌的菌絲在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中直徑最大，為最適碳源，其次為可溶性淀粉，在D-果糖中長勢緩慢，菌落直徑小于缺碳處理（圖8）。

不同氮源對(duì)菌絲生長的影響：病原菌菌絲在以大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中直徑最大，長勢最好，為最適氮源，其次為L-天冬酰胺，以氯化銨、硫酸銨和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基中長勢緩慢，菌落直徑小于缺氮處理（圖9）。

3 討論

可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]也稱可可球二孢菌（Botrydiplodia theobromae Pat.）[15，18]，可侵染菠蘿、番木瓜、柚子、木菠蘿、芒果、香蕉、柑桔、番石榴、無花果、腰果、可可、山竹、桑樹、麻風(fēng)樹、桉樹、沉香、木薯等植物的果實(shí)、葉片、枝干或根，引起焦腐、蒂腐、潰瘍、枝枯、流膠、回枯和根腐等癥狀[1， 6， 15-16， 18-35]，2012年Nghia報(bào)道在越南的橡膠上分離到Botryodiplodia theobromae，Lasiodiplodia theobromae可侵染橡膠木、楊木、松木等引起木材藍(lán)變[5， 36-40]。目前在中國尚未見由可可球二孢引起橡膠回枯病的相關(guān)報(bào)道。橡膠樹回枯病的主要癥狀為小枝受害后先干枯，蔓延到莖干后由上到下回枯，木質(zhì)部組織發(fā)生藍(lán)變，莖干上有時(shí)伴隨流膠，與胡美姣等[16]報(bào)道的芒果樹回枯病、Frrari等[23]報(bào)道的柑桔回枯病、Ang Boon Beng[1]和Mbenoun等[27]報(bào)道的可可突發(fā)性回枯病等癥狀相類似。本研究對(duì)引起海南橡膠幼樹回枯病的病原菌進(jìn)行形態(tài)鑒定及分子生物學(xué)分析，鑒定其為可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maub]，這是國內(nèi)發(fā)現(xiàn)此菌可引起橡膠樹枝干病害。在病原菌的分子鑒定中利用了4組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中3組特異性引物的運(yùn)用進(jìn)一步增強(qiáng)了病原菌分子鑒定的準(zhǔn)確性。

病原菌人工接種可侵染番薯塊莖引起組織藍(lán)變，也能侵染芒果果實(shí)呈現(xiàn)黑褐色病斑。利用木屑培養(yǎng)基可誘導(dǎo)產(chǎn)生子實(shí)體。該病原菌最適生長溫度為30 ℃，與前人的研究結(jié)果基本一致[16， 41]。病原菌最適生長pH值為4，與黃思良等[41]研究所得出的可可球二孢最適pH為5.0～5.5相比更偏酸性；最適碳源為葡萄糖，最適氮源為大豆蛋白胨，這與胡美姣

等[16]研究報(bào)道的芒果上的可可球二孢對(duì)碳、氮源選擇不嚴(yán)格的結(jié)果不盡相同；且病原菌在不同光照條件的菌絲生長速度基本一致，這也與劉媛等[42]和楊波等[28]研究的可可球二孢菌喜光不同，是否由于寄主不同存在小種差異有待進(jìn)一步研究。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，海南橡膠幼樹回枯病主要發(fā)生在3～7月高溫、干旱、少雨的季節(jié)，且膠園地面植被少或覆蓋少、陽光易曝曬的時(shí)間長、膠樹抗性弱時(shí)發(fā)病嚴(yán)重；研究發(fā)現(xiàn)病原菌易從枝條上的傷口侵入，嫩莖被侵染后發(fā)病迅速，易枯死，對(duì)橡膠幼樹存在較大危害性，在生產(chǎn)防治中應(yīng)給予高度重視并加強(qiáng)監(jiān)測和防控。

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