大孔樹脂對紅心火龍果莖多糖脫色除蛋白及抗氧化活性的影響

馬若影 李幼梅 鄧志勇 陳逸婷 邢燕妮 白新鵬

摘 要 為了提高紅心火龍果莖多糖的純度，并了解大孔樹脂處理對多糖抗氧化活性的影響，本研究以多糖脫色除蛋白的效果和多糖保留率為評價指標(biāo)，從6種大孔樹脂中篩選出最佳脫色效果的樹脂，以單因素試驗為基礎(chǔ)通過正交試驗設(shè)計對大孔樹脂脫色除蛋白工藝條件進行優(yōu)化，并進行抗氧化活性研究。結(jié)果表明，AB-8樹脂效果最佳，最佳工藝條件為：樹脂用量0.6 g/mL，溫度60 ℃，pH為5，時間2 h。此條件下得到的脫色率、蛋白去除率和多糖保留率分別為76.51%、88.29%和83.47%?？寡趸钚詫嶒灲Y(jié)果表明，火龍果莖多糖具有一定的抗氧化能力，大孔樹脂處理后其抗氧化活性有所提高。

關(guān)鍵詞 紅心火龍果莖；多糖；大孔樹脂；脫色；除蛋白；抗氧化活性

中圖分類號 TQ281 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract In order to improve the purity of polysaccharide， six kinds of resins were uesd in this study. Based on the decolorization and deproteinization rate， a suitable resin was selected and process parameters were optimized. The effect of macroporous resin on the antioxidant activity of polysaccharides was studied. AB-8 was better than the other five resins. Decolorization and deproteinization experiments were carried out by single factor and orthogonal experiments. The optimum technological conditions are as follows： liquid/solid ratio 0.6 g/mL， temperature 60℃， pH 5.0 ， and time 2.0 h . Under the conditions the polysaccharide retention， the decolorization rate and the deproteinization rate was 86.46%， 93.39% and 98.32%， respectively. The antioxidant activity of polysaccharide was enhanced after decoloring by macroporous resin.

Keywords red pitaya stem； polysaccharide； macroporous resin； decolorization； deproteinization； antioxidative activity

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.006

火龍果（Hylocereus undatus）又稱紅龍果、仙蜜果等，屬仙人掌科，起源于美洲，富含糖、有機酸、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種具有高營養(yǎng)保健價值的熱帶水果[1-3]。因此，火龍果作為功能成分的來源，提供可能預(yù)防相關(guān)疾病的營養(yǎng)素，有利于改善消費者的身心健康[4]。目前我國關(guān)于紅心火龍果的研究屢見不鮮，但火龍果莖的研究較少，其產(chǎn)業(yè)仍處于起步階段，有著廣闊的發(fā)展前景。據(jù)相關(guān)文獻報道，火龍果莖中含豐富的植物性多糖，具有美白、保濕、抗氧化等多種活性作用[5-6]。

火龍果莖經(jīng)提取后，獲得的粗多糖仍含有少量雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、色素等。傳統(tǒng)的除蛋白脫色的方法有鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑法、酶解法等；脫色方法有活性炭吸附、過氧化氫脫色和透析等，這些方法各具特點，但易破壞多糖結(jié)構(gòu)，影響其活性，且不可應(yīng)用于食品級多糖的生產(chǎn)[7]。大孔樹脂擁有穩(wěn)定的理化性質(zhì)和良好的吸附效果，操作和再生簡易，價格便宜，且保留多糖基本性質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化[8-9]。大孔樹脂已被應(yīng)用于木糖等單糖的生產(chǎn)純化過程[10]。藍海波等[11]關(guān)于龍眼多糖脫色除蛋白的研究中，采用D301-R樹脂進行優(yōu)化試驗獲得較高的多糖保留率（93.37%）。趙肖通等[12]篩選出D3520樹脂對姬松茸多糖脫色，脫色率可高達88.5%。古靜燕等[13]篩選出LS-46D樹脂去除金針菇粗多糖中的蛋白，使多糖純度從22.4%提高到58.3%。本研究篩選出火龍果莖多糖純化的理想大孔樹脂，以單因素試驗為基礎(chǔ)，通過正交試驗優(yōu)化得到最佳脫色除蛋白工藝條件，并比較大孔樹脂處理前后火龍果莖多糖的抗氧化活性，既有助于進一步研究火龍果莖多糖，也給工業(yè)化生產(chǎn)提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果莖（凍干粉）是由海南省東方市北緯十八度果業(yè)有限公司提供的大紅二號果實果莖；大孔樹脂：南開大學(xué)化工廠、滄州寶恩化工有限公司，試驗中用到的其他常規(guī)試劑均為分析純。

GL-20G-II型高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；85-1恒溫磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；SHZ-B水浴恒溫震蕩器，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；FDU-2100冷凍干燥機，埃朗科技國際貿(mào)易（上海）有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；723PC可見分光光度計，上海奧普勒儀器有限公司；EL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；亞臨界裝置，實驗室自主研制。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 采用亞臨界裝置提取火龍果莖多糖[14]：火龍果莖凍干粉按料液比1：50加入蒸餾水復(fù)水20 min，140 ℃提取25 min，離心后取上清液旋蒸濃縮并加入無水乙醇至乙醇體積分數(shù)為80%，4 ℃靜置沉淀12 h，然后于6 000 r/min的條件下離心5 min，保留沉淀，凍干后按實驗需要進行復(fù)溶備用。

1.2.2 大孔樹脂的預(yù)處理 用去離子水溶脹后去除浮在水表的大孔樹脂，將篩選出的大孔樹脂浸泡于5%HCl 24 h，水洗至pH為7后置于70%乙醇中24 h，去離子水洗至無白色渾濁現(xiàn)象后轉(zhuǎn)移到濃度為700 mg/L的NaOH中靜置24 h，水洗至中性后室溫下干燥，備用[15]。

1.2.3 分析方法 多糖保留率：計算公式為多糖保留率=（CT1–CR1）/（CT0–CR0）×100%，式中，CT0、CT1分別為吸附前后的總糖含量（mg/g）；CR0、CR1分別為吸附前后的還原糖含量（mg/g）。采用苯酚硫酸法測總糖含量[16]，采用3，5-二硝基水楊酸法測還原糖含量[17]。

蛋白質(zhì)去除率：采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[18]。蛋白質(zhì)去除率=（No1–No2）/No1×100%，式中，No1和No2分別為吸附前后的蛋白質(zhì)含量（mg/g）。

脫色率測定：多糖溶液pH調(diào)節(jié)至6.5±0.1，8 000 r/min離心15 min后抽濾，420 nm處測定OD值。脫色率=（OD前–OD后）/OD前×100%，式中，OD前和OD后分別為吸附前后溶液的光密度值。

1.2.4 大孔樹脂效果評價 以多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率3項指標(biāo)進行加權(quán)求和[19]。得到公式：u=0.4x+0.3y+0.3z，式中，x表示多糖保留率（%），y表示蛋白質(zhì)去除率（%），z表示脫色率（%）。

1.2.5 篩選最佳大孔樹脂 稱量20.0 g樹脂與40 mL粗多糖加入100 mL錐形瓶混勻，放置在38 ℃、150 r/min條件下的搖床中2 h，抽濾，蒸餾水洗滌，濾液收集在一起，50 mL容量瓶定容。測多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率和脫色率，參照第1.2.4節(jié)進行評分。

1.2.6 單因素試驗

1.2.6.1 吸附溫度的確定 稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂6 g于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，調(diào)節(jié)pH為5，分別在30、40、50、60、70 ℃振搖2 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.6.2 pH的確定 稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂6 g于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，分別調(diào)節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，40 ℃振搖2 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.6.3 樹脂用量的確定 分別稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂2 、4 、6 、8 、10 g 于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，調(diào)節(jié)pH值為5，40 ℃振搖2 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.6.4 吸附時間的確定 稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂6 g于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，調(diào)節(jié)pH為5，40 ℃分別振搖1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.7 正交試驗設(shè)計 以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇吸附溫度、pH值、樹脂用量、吸附時間4個因素，如表1所示，進行L9（34）正交試驗，每組試驗做3次平行。

1.2.8 火龍果莖多糖大孔樹脂處理前后抗氧化活性的測定

1.2.8.1 清除DPPH自由基的能力測定 參考李莉[20]的方法進行實驗，DPPH自由基清除率計算式如下：

式中，Ai為1 mL待測液+1 mL DPPH工作液的吸光度值；Aj為1 mL待測液+1 mL甲醇的吸光度值；A0為1 mL DPPH工作液+1 mL甲醇的吸光度值。

1.2.8.2 清除羥自由基（OH）的能力測定 參考封燕[21]的方法進行實驗，羥自由基清除率計算式如下：

式中，Ai為多糖待測液的吸光度值；Aj為蒸餾水作空白試驗的吸光度值；A0為蒸餾水代替過氧化氫溶液的吸光度值。

1.2.8.3 總抗氧化能力和還原力的測定 參考Smirnoff等[22]和劉曉鵬等[23]的方法進行實驗。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)至少進行3次平行實驗和2次重復(fù)實驗，取平均值。統(tǒng)計學(xué)分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，正交試驗結(jié)果采用正交助手進行分析，用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選最佳大孔樹脂

火龍果莖多糖提取液中的主要雜質(zhì)是色素與蛋白質(zhì)，雜質(zhì)含量過高會影響下一步的分離純化及性質(zhì)測定。不同型號大孔樹脂的吸附性能對火龍果莖多糖純化過程中脫色除蛋白效果影響很大，樹脂的極性、比表面積和空間結(jié)構(gòu)是影響吸附性能的重要因素[24]。試驗選取NKA-9、DM301、D101、HPD700、S-8、AB-8這6種分子極性和顆粒理化性質(zhì)不同的大孔樹脂進行比較。其中，極性樹脂：NKA-9和S-8；弱極性樹脂：AB-8；中極性樹脂：HPD700和DM301；非極性樹脂：D101。這6種樹脂吸附后結(jié)果如表2所示。由表2可知，樹脂NKA-9、DM30、HPD700脫色效果較好，AB-8、HPD700蛋白質(zhì)去除率較高，AB-8蛋白質(zhì)去除率最高，且其多糖保留率也相對較高，綜合評分最高為（79.72±0.04）%。綜上所述，篩選AB-8樹脂作為后續(xù)實驗的樹脂。

2.2 單因素試驗

選擇吸附溫度、pH值、樹脂用量、吸附時間四個因素對火龍果莖多糖脫色除蛋白效果的影響進行單因素試驗，結(jié)果如圖1～4所示。

2.2.1 時間 由圖1可知，多糖保留率隨著吸附時間的延長而逐漸降低，蛋白去除率和脫色率逐漸升高。當(dāng)吸附時間超過2.0 h時，蛋白去除率和脫色率增加不顯著，但對多糖的吸附明顯增多。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的最佳吸附時間為2.0 h。

2.2.2 pH值 由圖2可知，pH值的變化對脫色除蛋白效果有明顯的影響。在一定pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，蛋白去除率和脫色率逐漸降低。然而低pH值條件下容易導(dǎo)致多糖性質(zhì)發(fā)生變化，使得多糖保留率急劇降低。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的適宜pH值為5。

2.2.3 樹脂用量 如圖3所示，隨著樹脂用量的增加，蛋白去除率和脫色率逐漸升高，當(dāng)樹脂用量超過0.6 g/mL時，蛋白質(zhì)去除率和脫色率增加緩慢，但增加了對多糖的吸附。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的樹脂適宜用量為0.6 g/mL。

2.2.4 溫度 如圖4所示，吸附溫度在30～50 ℃時，多糖保留率、蛋白去除率和脫色率隨著溫度的增加而逐漸提高，當(dāng)溫度高于50 ℃時，三者增長趨勢均趨于平緩。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的溫度為50 ℃。

2.3 正交試驗結(jié)果

由表3直觀分析表明，以多糖保留率、蛋白去除率和脫色率為評價指標(biāo)，按照第1.2.4節(jié)的評價方法綜合評分，大孔樹脂脫色除蛋白的最佳工藝組合為A2B2C2D3，即吸附時間1 h，吸附pH值為5，樹脂用量0.6 g/mL，吸附溫度60 ℃，各個因素對大孔樹脂脫色除蛋白的影響程度依次是樹脂用量>吸附時間>吸附溫度>pH值。

2.4 驗證實驗

在正交試驗確定的最佳提取條件下，進行多次驗證實驗，多糖保留率為（83.47±1.21）%，蛋白去除率為（88.29±1.56）%，脫色率為（76.51±1.63）%，綜合評分為（82.83±1.14）%，有較佳的脫色除蛋白效果，由此證明該工藝具有可行性。

2.5 抗氧化活性

由于不同抗氧化劑測定的理論基礎(chǔ)不同，單一的抗氧化活性研究難以真正反映樣品的抗氧化能力。因此，本研究采用4種方法來反映火龍果莖多糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖5～8所示。

2.5.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，能接受電子或氫自由基，形成穩(wěn)定的反磁性分子，抗氧化劑對DPPH自由基的清除原理，是基于它的供氫能力[25]。如圖5所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，火龍果莖多糖的質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖對DPPH自由基清除能力的IC50值分別為4.20 mg/mL和3.81 mg/mL，說明經(jīng)樹脂純化后的多糖較純化前對DPPH自由基的清除能力增強，這可能是因為經(jīng)大孔樹脂處理后的火龍果莖多糖得到了純化和富集。

2.5.2 OH清除能力 如圖6所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，火龍果莖多糖質(zhì)量濃度與其OH清除率成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖對OH清除能力的IC50值分別為3.80 mg/mL和3.51 mg/mL，說明經(jīng)樹脂純化后的多糖較純化前對OH的清除能力略有增強。

2.5.3 總還原能力 如圖7所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，火龍果莖多糖的質(zhì)量濃度與總還原能力成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖均有較好的還原能力，且純化后較純化前略有提高。

2.5.4 總抗氧化能力 如圖8所示，在一定的火龍果莖多糖的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其總抗氧化能力與質(zhì)量濃度成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖均有較好的總抗氧化能力，且純化后較純化前略有提高。

3 討論

大孔樹脂具有可再生、吸附快、選擇性好等特點，廣泛應(yīng)用于多糖脫色除蛋白中[26]。方婷等[27]通過研究豬肚菇粗多糖脫色除蛋白工藝，表明采用酶法和sevag及大孔樹脂聯(lián)合的方法可以有效脫色除蛋白，羅璽等[28]采用D303樹脂對靈芝多糖進行脫色除蛋白，脫色率高達91.89%。綜上所述，采用大孔樹脂對紅心火龍果莖多糖脫色除蛋白的方法具有可行性。本研究將脫色除蛋白前后的多糖性質(zhì)進行比較，初步證實了粗多糖的抗氧化活性是多糖的性質(zhì)，不受其他雜質(zhì)的影響，能在原來的基礎(chǔ)上適當(dāng)提高其抗氧化活性。

本研究通過比較6種樹脂對火龍果莖多糖靜態(tài)吸附后的脫色除蛋白效果，確定AB-8為理想樹脂。通過單因素和正交試驗設(shè)計，以多糖保留率、蛋白去除率和脫色率為評價指標(biāo)篩選出最佳脫色除蛋白條件：樹脂用量0.6 g/mL，溫度60 ℃，pH為5，時間2 h，此條件下得到的脫色率、蛋白去除率和多糖保留率分別為76.51%、88.29%和83.47%。

對火龍果莖多糖進行純化前后抗氧化對比實驗。結(jié)果表明，純化前的粗多糖本身具有較好的抗氧化活性，且抗氧化能力與它們的濃度有明顯的量效關(guān)系。經(jīng)過AB-8樹脂處理后，其抗氧化活性有所提高，為火龍果莖多糖的純化奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 張桂春， 劉玉靜， 李延敏， 等. 火龍果果皮中可溶性膳食纖維的提取方法[J]. 植物學(xué)報， 2017， 52（5）： 622-630.

[2] Castro J C， Endo E H， Souza M R D， et al. Bioactivity of essential oils in the control of Alternaria alternata， in dragon fruit （Hylocereus undatus Haw.）[J]. Industrial Crops & Products， 2017， 97： 101-109.

[3] 王 彬， 鄭 偉， 蔡永強. 火龍果果實發(fā)育期間營養(yǎng)元素含量的變化[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2015， 36（7）： 1 242-1 246.

[4] Wichienchot S， Jatupornpipat M， Rastall R A. Oligosaccharides of pitaya （dragon fruit） flesh and their prebiotic properties[J]. Food Chemistry， 2010， 120（3）： 850-857.

[5] 王文康. 淺析火龍果豐產(chǎn)栽培技術(shù)[J]. 農(nóng)民致富之友， 2016 （16）： 191.

[6] 李 鵬. 火龍果莖凝膠汁、多糖的初步研究[D]. 北京： 首都師范大學(xué)， 2009.

[7] 劉 芳， 朱學(xué)慧， 劉 玫， 等. 冬凌草多糖脫蛋白和脫色方法的研究[J]. 中藥材， 2008， 31（5）： 751-753.

[8] 龔 敏， 趙德前， 孫慧潔. 大孔吸附樹脂對藥桑多糖的脫色及抗氧化活性影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2016， 32（33）： 147-150.

[9] 劉曉庚， 賈紅圣， 曹崇江. 大孔吸附樹脂分離純化女貞子原花青素的動力學(xué)和熱力學(xué)研究[J]. 中國糧油學(xué)報， 2009， 24（1）： 124-128.

[10] 丁勝華， 歐仕益. 活性炭和大孔離子樹脂對蔗渣低聚木糖的脫色效果研究[J]. 食品科技， 2010， 35（7）： 107-110.

[11] 藍海波， 溫亞州， 楊光美， 等. 龍眼多糖樹脂脫色除蛋白工藝優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2016， 37（8）： 1 558-1 566.

[12] 趙肖通， 解軍波， 潘炳成， 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化姬松茸多糖的脫色工藝[J]. 食品工業(yè)科技， 2016， 37（9）： 207-212.

[13] 古靜燕， 李新勝， 馬 超， 等. 大孔吸附樹脂去除金針菇粗多糖中蛋白的研究[J]. 食品工業(yè)， 2016， 37（3）： 51-53.

[14] 馬若影， 楊慧強， 李國勝， 等. 亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖及其抗氧化活性[J]. 食品工業(yè)科技， 2017， 38（10）： 286-290.

[15] 李幼梅， 周 楷， 白新鵬， 等. 大孔樹脂吸附純化番木瓜籽總?cè)蒲芯縖J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2015， 6（6）： 2 171-2 178.

[16] Dubois M， Gilles K A， Hamilton J K， et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry， 1956， 28（3）： 350-356.

[17] 趙 凱， 許鵬舉， 谷廣燁. 3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J]. 食品科學(xué)， 2008， 29（8）： 534-536.

[18] 王文平， 郭祀遠， 李 琳， 等. 考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質(zhì)的含量[J]. 食品研究與開發(fā)， 2008， 29（1）： 115-117.

[19] 藍海波， 溫亞州， 楊光美， 等. 龍眼多糖樹脂脫色除蛋白工藝優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2016， 37（8）： 1 558-1 566.

[20] 李 莉. 文蛤多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)分析及抗氧化、免疫活性初步研究[D]. 無錫： 江南大學(xué)， 2015.

[21] 封 燕. 金蟬花多糖的結(jié)構(gòu)特征及免疫活性初步研究[D]. 鎮(zhèn)江： 江蘇大學(xué)， 2016.

[22] Smirnoff N， Cumbes Q J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry， 1989， 28（4）： 1 057-1 060.

[23] 劉曉鵬， 張俊霞， 姜 寧， 等. 響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲輔助提取連錢草多糖工藝及其體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（4）： 13-19.

[24] 王旭蘋， 楊 磊， 楊小蘭， 等. 大孔樹脂純化酒花多酚及其組成分析[J]. 食品科學(xué)， 2013， 34（22）： 15-20.

[25] Blois M S. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical[J]. Nature， 1958， 181（4617）： 1 199-1 200.

[26] 王躍生， 王 洋. 大孔吸附樹脂研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2006， 31（12）： 961-965.

[27] 方 婷， 曾紅亮， 陳曉垚， 等. 豬肚菇粗多糖脫蛋白脫色工藝優(yōu)化研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2015， 36（6）： 1 166-1 172.

[28] 羅 璽， 唐慶九， 張勁松， 等. 靈芝多糖樹脂法脫色工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)， 2011， 32（16）： 5-10.