擬除蟲菊酯類殺蟲劑對赤擬谷盜CYP4基因的誘導(dǎo)表達特性

梁曉 伍春玲 陳青 徐雪蓮

摘 要 昆蟲細胞色素P450的CYP4家族基因是在殺蟲劑誘導(dǎo)表達和抗藥性研究方面涉及最多的基因家族之一。擬除蟲菊酯類殺蟲劑是防治赤擬谷盜的常用藥劑，當(dāng)前已有較多抗藥性相關(guān)報道，但尚缺乏多個擬除蟲菊酯農(nóng)藥對赤擬谷盜CYP4家族P450基因誘導(dǎo)表達特性的研究。本研究首先選取4個赤擬谷盜CYP4家族P450基因CYP4G7、CYP4G14、CYP4BR1和CYP4BR3，然后用氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分別以不同濃度和時間處理20 d幼蟲，并采用熒光定量PCR分析P450基因的誘導(dǎo)表達特性。結(jié)果表明，4個P450候選基因中僅有CYP4G7不僅可以被供試的3種菊酯類藥劑顯著誘導(dǎo)，并且LC20處理24 h和1/4 LC20處理6 h兩種處理濃度對CYP4G7的誘導(dǎo)水平無顯著差異。本研究結(jié)果表明亞致死劑量擬除蟲菊酯類殺蟲劑6 h處理即可導(dǎo)致赤擬谷盜CYP4家族P450基因表達量的顯著提高，為延緩上述3種殺蟲劑抗藥性合理防治赤擬谷盜提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 擬除蟲菊酯農(nóng)藥；赤擬谷盜；P450基因；CYP4家族；誘導(dǎo)特性

中圖分類號 S433.1 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Cytochrome P450 gene from CYP4 family is one of the most important gene family which is related to xenobiotic-triggered induction and insecticide resistance. Pyrethroids are the common insecticides applied in the control of the red flour beetle， Tribolium castaneum， and there are several resistance cases reported up to now. However， there are lack of studies regarding the induction of P450 genes from CYP4 family in T. castaneum when treated by different pyrethroid insecticides. In this study， four P450 genes CYP4G7， CYP4G14， CYP4BR1 and CYP4BR3 from 20-d larvae were selected as the candidate genes for the analysis of the transcription when treated by cypermethrin， lambda-cyhalothrin and permethrin respectively. The results showed that among the candidate P450 genes only CYP4G7 could be significantly induced by all the pyrethroids， moreover， the transcription of CYP4G7 under treatment of LC20 for 24 h showed no significant difference when compared to the treatment of 1/4 LC20 for 6 h. The study demonstrated that the induction of CYP4G7 was rapid and only required subletheal concentrations， which could provide a theoretical basis for T. castaneum control and delay the development of resistance to those three pyrethroid insecticides.

Keywords pyrethroid insecticides； Tribolium castaneum； cytochrome P450； CYP4 family； induction pattern

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.021

隨著擬除蟲菊酯類殺蟲劑在害蟲防治中的廣泛應(yīng)用，害蟲對此類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的報道越來越多，其中以代謝抗性機制的研究較為普遍。昆蟲體內(nèi)細胞色素P450酶（P450s）、羧酸酯酶（CarE）及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）這3類解毒酶的活性及相關(guān)基因表達量的異常變化是昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生代謝抗性的主要原因[1]，這3類解毒基因又以P450s家族類型最多，數(shù)量最為龐大。近年來許多研究表明，僅僅單個P450基因的表達量顯著升高就可導(dǎo)致害蟲對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的抗性的顯著增加，例如，抗溴氰菊酯油菜花露尾甲（Meligethes aeneus）幼蟲和成蟲體內(nèi)CYP6BQ23表達水平比敏感品系提高多達900倍[2]；抗溴氰菊酯赤擬谷盜體內(nèi)CYP6BQ9基因表達水平比敏感品系提高200多倍[3]；CYP6P4?[4]、CYP6P12[5]、CYP6Z1[6]和CYP9A[7]的過表達是阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis）、白紋伊紋（Aedes albopictus）、不吉按蚊（Anopheles funestus）、東亞飛蝗（Locusta migratoria）對擬除蟲菊酯殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要原因。

赤擬谷盜[Tribolium castaneum （Georgia）]是為害嚴(yán)重的世界性儲糧害蟲[8-9]，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥依然是赤擬谷盜藥劑防治過程中使用較多的殺蟲劑類型。研究表明，擬除蟲菊酯農(nóng)藥處理可以誘導(dǎo)害蟲多個P450基因表達水平的顯著提高[10]，并且與P450s相關(guān)的擬除蟲菊酯農(nóng)藥代謝抗性機理，也往往涉及來自不同家族的多個P450基因[11]。當(dāng)前關(guān)于P450s誘導(dǎo)表達或抗性相關(guān)研究中，CYP4家族是報道較多的基因家族，該家族P450基因在擬除蟲菊酯脅迫下的誘導(dǎo)表達在德國小蠊[12]、埃及伊蚊[10]、致倦庫蚊[13]、棉鈴蟲[14]等害蟲研究中得到闡釋。然而一方面，國內(nèi)外尚缺乏同類藥劑不同品種處理下害蟲P450基因誘導(dǎo)表達的相關(guān)報道；另一方面，當(dāng)前菊酯類殺蟲劑處理下赤擬谷盜CYP4家族基因的誘導(dǎo)表達情況尚不清楚。因此，本研究首先通過生物信息學(xué)分析從赤擬谷盜CYP4家族所有P450基因中選取若干個可能被誘導(dǎo)的候選基因，然后通過不同菊酯類農(nóng)藥處理確定能夠被誘導(dǎo)的基因，并進一步分析不同濃度，不同時間處理下這些P450基因的誘導(dǎo)模式，以期為合理使用擬除蟲菊酯類殺蟲劑防治赤擬谷盜，延緩其抗性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 赤擬谷盜為堪薩斯州立大學(xué)（Kansas State University）昆蟲系實驗室飼養(yǎng)的Georgia-1（GA-1）品系。赤擬谷盜飼養(yǎng)參照肖達[15]的方法進行。

1.1.2 供試藥劑 氯氰菊酯（98%）、λ-三氟氯氰菊酯（96.8%）和氯菊酯（97.5%）標(biāo)準(zhǔn)品購自Chem Service（West Chester，PA）。cDNA第一鏈合成試劑盒，Maxima? SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒均為Fermentas公司產(chǎn)品（Fermentas， Glen Burnie，MD）。其他所需緩沖液均按照《分子克隆實驗指南（第3版）》配制。

1.2 方法

1.2.1 可被不同菊酯類農(nóng)藥誘導(dǎo)的候選P450基因的選擇 選擇赤擬谷盜CYP4家族所有的P450基因，以及其他昆蟲來源的CYP4家族的P450基因（在外源化合物誘導(dǎo)或者抗藥性方面功能已知，具體信息參見表1）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。P450基因氨基酸序列由美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）得來。不同的P450基因采用Mega 5.0軟件的CLustalW模塊進行氨基酸序列比對，并采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。與其他昆蟲功能已知的P450基因聚類于同一分支的赤擬谷盜P450基因?qū)⒆鳛楸徊煌挣ヮ愞r(nóng)藥誘導(dǎo)的候選基因進行下一步研究。

1.2.2 赤擬谷盜的生物測定方法 將0.5 mL系列濃度的農(nóng)藥（丙酮配制）加入20 mL的玻璃小瓶中，往玻璃小瓶內(nèi)通氮氣直至丙酮完全揮發(fā)（對照為0.5 mL丙酮）；氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯設(shè)置的濃度梯度均為：CK（0）、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 μg/mL；氯菊酯設(shè)置的濃度梯度為CK（0）、6.25、12.5、25、50、75、100、200 μg/mL；將20 d赤擬谷盜幼蟲放入上述用藥處理過的玻璃瓶中，并于培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)24 h（30 ℃，65%濕度），每個處理濃度（包括對照）設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭幼蟲；記錄各個處理濃度下的幼蟲死亡數(shù)，用SAS 9.1.3進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 qRT-PCR測定方法 赤擬谷盜總RNA的提取參照RNA提取試劑盒進行。采用2.0 μg RNA（DNAase去除基因組DNA）用于cDNA的合成。cDNA樣品經(jīng)nuclear-free水稀釋8倍后作為熒光定量PCR的模板。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。qPCR的引物設(shè)計用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計。內(nèi)參基因采用赤擬谷盜在不同齡期和組織中均穩(wěn)定表達的ribosomal protein S3（TcRps3）基因來設(shè)計[16]。引物信息如表2所示。

1.2.4 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對赤擬谷盜CYP4家族P450s的誘導(dǎo)表達測定 以不同菊酯類農(nóng)藥的LC20處理赤擬谷盜20 d幼蟲，處理方法同生物測定，每個濃度（包括對照）設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭幼蟲。24 h后每個重復(fù)取存活幼蟲4頭提取RNA，通過qRT-PCR測定分析候選P450基因的誘導(dǎo)表達情況。

1.2.5 不同擬除蟲菊酯農(nóng)藥對赤擬谷盜CYP4家族P450基因的誘導(dǎo)模式 為比較不同處理濃度和處理時間對CYP4家族P450基因誘導(dǎo)表達的影響，同時減少實驗處理，先以氯氰菊酯為處理藥劑，比較LC20以及1/4 LC20兩個不同濃度處理時赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)情況，確定1/4 LC20也能誘導(dǎo)P450s表達后，再分別比較該濃度處理6、12、24、48 h對表達量的影響，確定能夠誘導(dǎo)的最短時間。隨后將最終確定的氯氰菊酯的濃度設(shè)置方法和時間分別應(yīng)用于其他菊酯類農(nóng)藥，進一步評價P450基因的誘導(dǎo)表達情況。實驗操作參照生物測定方法，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭幼蟲。

1.3 數(shù)據(jù)分析

生物測定時LC50、LC20、卡方值（χ2）等參數(shù)的計算采用SAS軟件（SAS 9.1.3，SAS Institute Inc. USA，1996）進行。顯著性差異分析采用Students t-test方法以及One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有數(shù)據(jù)均為3個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（ ±SE），顯著性檢測水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬除蟲菊酯農(nóng)藥誘導(dǎo)相關(guān)的赤擬谷盜CYP4家族P450基因分析

圖1結(jié)果表明，盡管用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的赤擬谷盜CYP4家族P450基因多達25個，但大部分P450基因傾向于在某一個亞家族內(nèi)聚類（如CYP4B和CYP4Q亞家族），而僅有CY4BR1、CYP4BR3、CYP4G7和CYP4G14這4個基因能夠與其他昆蟲來源的，在外源化合物誘導(dǎo)和抗藥性方面功能已知的P450基因聚集于同一分支，表明這些基因的相似度較高，在功能上可能也有相似之處，因此最終選擇這4個P450基因作為候選基因進一步研究不同菊酯農(nóng)藥處理時的誘導(dǎo)表達情況。

2.2 不同擬除蟲菊酯農(nóng)藥對赤擬谷盜的毒力

由表3生物測定結(jié)果可知，赤擬谷盜20 d幼蟲對農(nóng)藥的敏感性順序為：氟氯氰菊酯>氯氰菊酯>氯菊酯，3種藥劑的LC50分別為4.24、7.77、77.46 μg/mL。最終以3種藥劑的LC20測定分析藥劑處理下赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)情況，具體的處理濃度分別為：三氟氯氰菊酯（2 μg/mL）、氯氰菊酯（2 μg/mL）、氯菊酯（16 μg/mL）。

2.3 不同擬除蟲菊酯農(nóng)藥處理對赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)表達特性

由圖2可知，氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分別以LC20濃度處理赤擬谷盜20 d幼蟲時，僅有CYP4G7能同時被供試的3種藥劑顯著誘導(dǎo)（p<0.05），誘導(dǎo)上調(diào)倍數(shù)分別為1.97、1.73和2.00倍，而其余P450基因在藥劑處理前后表達量并無顯著差異（p<0.05）。

2.4 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對赤擬谷盜CYP4家族P450基因的誘導(dǎo)模式

圖3結(jié)果表明，LC20和1/4 LC20濃度處理都能夠誘導(dǎo)CYP4G7基因的顯著上調(diào)（p<0.05），

并且表達量提高倍數(shù)無顯著差異（p<0.05）。進一步比較亞致死劑量，即1/4 LC20（試蟲24 h平均死亡率低于5%）處理不同時間對CYP4G7表達量變化趨勢時發(fā)現(xiàn)，處理6 h表達量即可顯著上調(diào)1.92倍，并在處理12 h（2.07倍）和24 h（1.89倍）后仍處在顯著上升水平（p<0.05）；而處理48 h后雖然表達水平仍高于對照，但兩者已無顯著差異（p<0.05）。將上述處理條件（1/4 LC20，6 h）應(yīng)用于所有菊酯農(nóng)藥，結(jié)果表明，對于任意一種菊酯農(nóng)藥，2種處理方式均可導(dǎo)致CYP4G7表達量的顯著提高（圖4），并且提高倍數(shù)無顯著差異（p<0.05）。

3 討論

昆蟲細胞色素P450基因的誘導(dǎo)與藥劑種類密切相關(guān)。首先，不同藥劑誘導(dǎo)的P450基因有顯著差別。例如，沙蠶毒素、二嗪農(nóng)、虱螨脲和環(huán)蟲腈處理均不能誘導(dǎo)任何P450基因表達，DDT僅能夠誘導(dǎo)一個CYP12D1基因，而苯巴比妥處理可誘導(dǎo)十余個基因的表達[25]。其次，同一個P450基因能夠被不同藥劑誘導(dǎo)。例如，苯巴比妥和咖啡因處理均能顯著誘導(dǎo)果蠅CYP4E2和CYP4E3的表達[17]，敵敵畏和溴氰菊酯均能夠顯著誘導(dǎo)家蠶CYP4M5基因，生物堿、尼古丁均能顯著誘導(dǎo)煙草天蛾CYP4M1和CYP4M3基因[24]，再次，同種類型結(jié)構(gòu)相似的殺蟲劑往往可以誘導(dǎo)相同P450基因的表達，這在含氰基Ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥（如溴氰菊酯、氯菊酯）對棉鈴蟲[26]、家蠶[27]和岡比亞按蚊[19]P450基因的誘導(dǎo)研究中均得到體現(xiàn)。本研究結(jié)果進一步補充了上述理論，候選的4個P450基因僅有CYP4G7均能夠被上述3種菊酯類農(nóng)藥顯著誘導(dǎo)，其余3個基因CYP4G14、CYP4BR1和CYP4BR3均不能被任何一種藥劑誘導(dǎo)。然而，必須指出的是，本研究選擇3種菊酯農(nóng)藥是在赤擬谷盜防治中應(yīng)用較多的菊酯農(nóng)藥品種，但該類藥劑種類繁多，結(jié)構(gòu)差異大，因此本研究的實驗結(jié)果雖然不能夠完整反映該大類農(nóng)藥所有品種對赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)表達情況，但卻是對同類型農(nóng)藥誘導(dǎo)害蟲P450基因的首次初探。

昆蟲細胞色素P450基因的誘導(dǎo)隨藥劑處理濃度、時間和昆蟲種類而變化。研究發(fā)現(xiàn)用苯巴比妥、咖啡因和DDT分別處理果蠅時發(fā)現(xiàn)，較低濃度的藥劑處理即可顯著誘導(dǎo)若干個P450基因的表達，并且表達量隨著藥劑處理濃度和時間的增加而逐漸增強[17]。李婷[28]通過分析嗜蟲書虱的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)多數(shù)P450基因可被溴氰菊酯誘導(dǎo)上調(diào)，表達高峰多出現(xiàn)在藥劑處理24 h后。針對小菜蛾的研究發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯以亞致死劑量短時間處理能夠比用高濃度（EC50或LC50）長時間處理對某些P450基因的誘導(dǎo)更顯著，作者認為這可能與高濃度氯氰菊酯脅迫降低了害蟲的應(yīng)激反應(yīng)能力有關(guān)[29]。劉月慶等[30]也研究發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯只能在低劑量范圍內(nèi)（LD10）對甘藍夜蛾CYP9A90基因發(fā)揮誘導(dǎo)作用，劑量過高（LD30和LD50）反而無誘導(dǎo)效果。相反地，Guo等[31]發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗的CYP409A1和CYP408B1均可被不同濃度的（LD10、LD30和LD50）的溴氰菊酯所誘導(dǎo)。相似地，本研究結(jié)果顯示，采用亞致死劑量短時間處理可以獲得與LC20長時間處理相同的誘導(dǎo)效果，說明赤擬谷盜CYP4家族這幾個P450基因可以被不同濃度的氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分別誘導(dǎo)。

研究害蟲在殺蟲劑脅迫下的誘導(dǎo)模式對于其抗藥性的預(yù)測有重要參考價值。許多研究表明，容易被殺蟲劑誘導(dǎo)的P450基因通常與抗性相關(guān)基因同屬一個基因，這在埃及伊蚊-菊酯類農(nóng)藥（CYP6M11）[32]，小菜蛾-氯菊酯（CYP6BG1）[29]，果蠅-DDT（CYP6G1和CYP12D1）[33]的研究中得到體現(xiàn)。因此，當(dāng)抗藥性產(chǎn)生時，這些易于被誘導(dǎo)的P450基因可能作為潛在的抗性分子標(biāo)記基因而被優(yōu)先考慮。由于本研究發(fā)現(xiàn)不同的菊酯類農(nóng)藥低濃度處理均可顯著誘導(dǎo)赤擬谷盜CYP4G7的表達量上調(diào)，因此長時間使用不同菊酯類農(nóng)藥防治赤擬谷盜產(chǎn)生交互抗性的風(fēng)險較大，在實際生產(chǎn)中應(yīng)注意該類藥劑與其他藥劑的輪換使用，以延緩抗性的產(chǎn)生。

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