棉花SSR標(biāo)記在紅麻中的通用性

方書(shū)生 謝雄峰 祁建民 張列梅 徐建堂 林荔輝 張立武

摘 要 紅麻與棉花屬于錦葵科不同屬的天然纖維作物，利用棉花SSR引物的通用性可以豐富紅麻SSR標(biāo)記。本研究從陸地棉每條染色體上隨機(jī)均勻挑選10對(duì)SSR引物，共260對(duì)，對(duì)24份不同來(lái)源的紅麻種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示，139對(duì)（53.5%）引物擴(kuò)增出了清晰的條帶，128對(duì)（49.2%）引物表現(xiàn)出多態(tài)性，共擴(kuò)增出292條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.1條帶，平均多態(tài)信息量為0.5419。表明這些引物在紅麻中的通用性和多態(tài)性好。位于陸地棉染色體A1、A5和D8上的SSR引物在紅麻中擴(kuò)增多態(tài)性較高。聚類分析表明，24份紅麻種質(zhì)可分為2個(gè)類群，進(jìn)一步劃分為4個(gè)亞群，與地理來(lái)源和系譜關(guān)系較一致。這些結(jié)果既證實(shí)了棉花SSR引物應(yīng)用于紅麻是可行的，又有助于紅麻與棉花比較基因組學(xué)和遺傳育種研究。

關(guān)鍵詞 紅麻；SSR引物；遺傳多樣性；通用性

中圖分類號(hào) S31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Kenaf and cotton are natural fiber crops of the Malvaceae family in different genera， universality of SSR primers from cotton could enrich the SSR markers of kenaf. In this study， ten pairs of SSR primers were randomly and evenly selected from each chromosome of upland cotton. Totally， 260 pairs were used to test the polymorphism of 24 different varieties of kenaf. The results showed that 139 （53.5%） pairs of primers amplified clear bands， 128 （49.2%） pairs presented polymorphism. In total， 292 bands were amplified， and an average of 2.1 bands was amplified for each primer. The average of polymorphic information content was 0.5419. All these indicated that these primers from upland cotton had good universatility and polymorphism in kenaf. The SSRs locating on chromosomes A1， A5， and D8 on upload cotton showed high polymorphism in kenaf. Cluster analysis indicated that the 24 kenaf varieties could be divided into two groups， which were further divided into four subgroups， in according with geographical sources and pedigrees. These results confirmed that cotton SSR primers could be suitable for kenaf and be useful in comparative genomics and genetic breeding between kenaf and cotton.

Keywords kenaf； SSR primer； genetic diversity； universality

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.017

紅麻（Hibiscus cannabinus，2n=36），又稱作大槿麻、洋麻、鐘麻等，是世界上非常重要的一年生韌皮纖維作物，屬于錦葵科（Malvaceae）木槿屬二倍體植物[1]。紅麻韌皮纖維具有抑菌性強(qiáng)、透氣性高、吸濕性好、易染色、抗靜電、水分散失快、拉力強(qiáng)、降解性強(qiáng)等優(yōu)良特性，在工業(yè)上，其纖維可用于生產(chǎn)汽車的內(nèi)襯、輕型板材、手提袋、麻紡織、絨毛漿，而其莖干則用于生產(chǎn)麻炭及環(huán)境友好型的吸附材料，同時(shí)還可以轉(zhuǎn)化成乙醇、麻塑料，用于生產(chǎn)麻油，麻酵素等，是一種十分重要的工業(yè)原料作物。因此紅麻被稱為21世紀(jì)很有潛力的優(yōu)勢(shì)作物[2-3]。

微衛(wèi)星，又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSRs），是當(dāng)前運(yùn)用較廣、比較理想的一種分子標(biāo)記技術(shù)[4]，已經(jīng)成功地應(yīng)用于品種的鑒定、物種的分類比較及遺傳圖譜構(gòu)建等研究[5]。但是，由于紅麻基因組尚未破譯，目前應(yīng)用到紅麻中的SSR標(biāo)記比較有限，這直接影響了紅麻的遺傳育種研究。因此，開(kāi)發(fā)出新的SSR引物顯得十分重要。當(dāng)前，獲得SSR引物的途徑主要有3種：一是在基因組文庫(kù)中進(jìn)行篩選，如Mir等[6]開(kāi)發(fā)黃麻SSR引物；二是在GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)中查詢，如黃麻EST-SSR引物開(kāi)發(fā)[7]；三是從近緣物種中獲得已設(shè)計(jì)好的引物，如Satya等[8]探索棉花和黃麻的SSR引物在錦葵科22個(gè)不同屬的多態(tài)性。盡管課題組前期利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)了11 083對(duì)HcEMS編號(hào)的SSR引物[9]和94對(duì)HcES編號(hào)的SSR引物[10]，但未探索紅麻與近緣物種的SSR通用性。物種間的SSR側(cè)翼序列相對(duì)保守，從某一物種中篩選出SSR引物用于其近緣種屬的擴(kuò)增，是一種效率高、成本低、實(shí)用性強(qiáng)的獲取標(biāo)記的途徑[8]。

紅麻與棉花同屬于錦葵科，兩者之間具有較好的共線性[9]。與棉花相比，紅麻的遺傳研究進(jìn)展相對(duì)落后。利用棉花遺傳信息加強(qiáng)紅麻的遺傳育種研究，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新基因、創(chuàng)造新種質(zhì)、培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)適應(yīng)性強(qiáng)的紅麻品種具有重要意義。陸地棉已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了大量的SSR引物[11]，其通用性也在非同源物種香蕉中得到了驗(yàn)證[12]。武耀龍等[13]利用64對(duì)棉花引物在紅麻中初步進(jìn)行了通用性的研究，但該實(shí)驗(yàn)使用的棉花SSR引物和紅麻實(shí)驗(yàn)材料偏少。本研究擬通過(guò)260對(duì)陸地棉SSR引物在24份紅麻基因組中的擴(kuò)增情況來(lái)檢測(cè)棉花引物在紅麻中是否通用，評(píng)價(jià)多態(tài)性比例，一方面為紅麻提供更多的SSR標(biāo)記，另一方面有助于紅麻與棉花的比較基因組學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

以24份不同原產(chǎn)地的紅麻種質(zhì)資源為實(shí)驗(yàn)材料，如表1所示，均由福建農(nóng)林大學(xué)麻類遺傳育種與綜合利用實(shí)驗(yàn)室提供。2016年5月1日種植于福建省三明市尤溪縣福建農(nóng)林大學(xué)洋中科教基地。

1.2 方法

1.2.1 紅麻基因組DNA的提取 使用改良的CTAB法提取紅麻基因組DNA[14]，提取后的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定。當(dāng)DNA濃度符合要求（OD260/ OD280在1.8～2.0）時(shí)，將提取的DNA用TE溶液稀釋到50 ng/μL，于–20 ℃保存，用于PCR的擴(kuò)增。

1.2.2 SSR引物挑選 本研究從陸地棉每條染色體上隨機(jī)挑選10對(duì)SSR引物[11]，如附表1所示，共260對(duì)SSR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與PAGE電泳檢測(cè) PCR體系為：2.0 μL DNA溶液（50 ng/L），0.5 μL 引物（forward+reverse），3.75 μL 2×Taq Master Mix（廈門(mén)泰京生物技術(shù)有限公司），3.75 μL ddH2O，組成10 μL的PCR體系，加10 μL液體石蠟油覆蓋，離心后混勻用于PCR。

PCR的程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s（每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃），72 ℃延伸45 s，一共10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

利用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測(cè)，其實(shí)驗(yàn)方法參考萬(wàn)雪貝等 [10]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)的記錄與分析

根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記的片段大小估算擴(kuò)增片段的大小。采用0和1的讀帶方法，有帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”。再利用NTSYSpc2.1e軟件對(duì)24份紅麻材料進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花SSR引物在紅麻中的擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)

陸地棉共26條染色體，分成A基因組染色體（A1～ A13）和D基因組染色體（D1～ D13） 。每條染色體上選取10對(duì)引物，共260對(duì)棉花SSR引物。260對(duì)棉花SSR引物在24份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增（附表1和圖1）。139對(duì)引物擴(kuò)增出了條帶（比例為53.5%），表明通用性較好，總共獲得292條帶。片段大小變化在70～720 bp，每對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)的條帶數(shù)變化在1～7條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.1條帶。計(jì)算其PIC（多態(tài)信息量），最小值為0.079 9（RES_008），最大值為0.900 6（RES_247），平均多態(tài)信息量為0.541 9，說(shuō)明了大部分棉花SSR引物在紅麻中具有較高的多態(tài)性，證實(shí)了棉花SSR引物應(yīng)用于紅麻是可行的。

在比較SSR引物通用性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了其多態(tài)性。在139對(duì)棉花SSR引物擴(kuò)增帶型中，128對(duì)在紅麻中表現(xiàn)出多態(tài)性，占所有引物的多態(tài)性比例為49.2%。從數(shù)據(jù)可以看出，棉花SSR引物在紅麻中多態(tài)性比率是較高的?？赡艿脑蚴敲藁ê图t麻屬于同科不同屬，具有一定的親緣關(guān)系，能夠形成良好的多態(tài)性。當(dāng)然，不同引物擴(kuò)增出來(lái)的多態(tài)性條帶數(shù)差異較大。其中，產(chǎn)生多態(tài)性條帶較多的引物是RES_45和RES_ 46、RES_244、RES_247，分別產(chǎn)生了7條和6條、6條、6條多態(tài)性條帶。

2.2 棉花不同染色體上的SSR引物在紅麻中的多態(tài)性分析

陸地棉各染色體的擴(kuò)增及多態(tài)性情況如圖2所示。其中A基因組的13條染色體中共有71對(duì)SSR引物可以在紅麻中擴(kuò)增出條帶，68對(duì)SSR引物表現(xiàn)出多態(tài)性，比率分別為54.6%和52.3%；D基因組的13條染色體中共有68對(duì)SSR引物可以在紅麻中擴(kuò)增出條帶，60對(duì)SSR引物表現(xiàn)出多態(tài)性，比率分別為52.3%和46.2%。說(shuō)明陸地棉A

基因組中的13條染色體上挑選出來(lái)的引物的擴(kuò)增率及多態(tài)性略高于D基因組染色體。

在A基因組染色體中，染色體A1、A5上各有9對(duì)SSR引物在紅麻中擴(kuò)增出來(lái)，表現(xiàn)出多態(tài)性的有9對(duì)，擴(kuò)增率和多態(tài)率都達(dá)到90%；染色體A8上只有1對(duì)SSR引物被擴(kuò)增出來(lái)，并表現(xiàn)出多態(tài)性，擴(kuò)增率和多態(tài)率為10%。在D基因組染色體中，染色體D8上有10對(duì)SSR引物在紅麻中擴(kuò)增出來(lái)，表現(xiàn)出多態(tài)性的有10對(duì)，擴(kuò)增率和多態(tài)率都達(dá)到100%；染色體D11上只有2對(duì)SSR引物被擴(kuò)增出來(lái)，表現(xiàn)出多態(tài)性的只有1對(duì)，擴(kuò)增率和多態(tài)率分別為20%和10%。從數(shù)據(jù)可以看出，棉花不同染色體上的SSR引物的擴(kuò)增率和多態(tài)率是不同的，A1、A5和D8染色體上SSR引物在紅麻的擴(kuò)增率和多態(tài)率最高，而A8和D11最低。這些分析可以為紅麻更有針對(duì)性地挑選多態(tài)性高的棉花染色體上的SSR引物。

2.3 基于棉花SSR標(biāo)記的紅麻種質(zhì)遺傳多樣性分析

應(yīng)用NTSYS軟件對(duì)24份紅麻種質(zhì)進(jìn)行聚類分析（圖3），遺傳相似系數(shù)最大的為0.87（80FH5和T19），而最小的為0.35。以遺傳相似系數(shù)0.58為閾值，可以把24份紅麻種質(zhì)分成兩個(gè)類群，其中類群1（Pop1）有且只有AfricaLY，類群2（Pop2）包括其他23份紅麻種質(zhì)。這說(shuō)明AfricaLY這一種質(zhì)同其他紅麻種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以將AfricaLY同其他23份紅麻種質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)。進(jìn)一步以遺傳相似系數(shù)0.64為閾值，可以把24份紅麻種質(zhì)分成4個(gè)亞群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中類群Pop1只有一個(gè)亞群（Ⅰ），有且只有AfricaLY；而Pop2有3個(gè)亞群（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。其中，亞群Ⅱ有42KD3、K57SCS11061、K56taihongZ等18個(gè)種質(zhì)，亞群Ⅲ有FH2、KG121和Zambia1共3個(gè)種質(zhì)，亞群Ⅳ有ZHM16、7380共2個(gè)種質(zhì)。24份紅麻種質(zhì)中，18份紅麻種質(zhì)在亞群Ⅱ中，表明亞群Ⅱ中的這些種質(zhì)的親緣關(guān)系比較近，遺傳差異較小。

3 討論

利用260對(duì)棉花SSR引物在紅麻中進(jìn)行擴(kuò)增，其中有139對(duì)引物擴(kuò)增出了條帶，比例為53.5%，但仍然有121對(duì)來(lái)自棉花基因組中的SSR引物還沒(méi)有被擴(kuò)增出來(lái)，可能是因?yàn)檫@些SSR的基因位點(diǎn)屬于棉花所特有的。課題組前期利用紅麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與棉花進(jìn)行共線性分析，發(fā)現(xiàn)8.99%基因是雷蒙德氏棉花所特有的[9]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR具有操作簡(jiǎn)便、高共顯性、高多態(tài)性等特點(diǎn)，但由于其擴(kuò)增位點(diǎn)較少，開(kāi)發(fā)成本高，所以研究物種之間SSR分子標(biāo)記的通用性有利于提高引物的利用效率，降低引物的開(kāi)發(fā)成本[15]。近幾年來(lái)，紅麻SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)比較少，研究者只能利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記， 如陶愛(ài)芬等[16]通過(guò)福紅2號(hào)等4份品種DNA為模板，篩選出了17對(duì)多態(tài)性較好的ISSR引物。很多研究表明，SSR引物在近緣物種以及一些遠(yuǎn)緣物種中都具有良好的通用性。盧玉飛等[17]通過(guò)用382對(duì)玉米SSR引物和100對(duì)甘蔗EST-SSR引物在84份芒屬材料中進(jìn)行通用性的實(shí)驗(yàn)，其中多態(tài)性比例分別為10.21%和13.00%。唐鑫等[18]研究發(fā)現(xiàn)，1824對(duì)西瓜基因組SSR引物在有棱絲瓜、苦瓜、冬瓜中的多態(tài)性比例分別為3.84%、1.81%和0.44%。付飛等[19]利用204對(duì)玉米SSR引物在高粱中進(jìn)行通用性分析，通用性比例和多態(tài)性比例分別為75%、27.9%。紅麻和棉花同屬于錦葵科不同屬的作物，本研究選取了260對(duì)棉花SSR引物對(duì)24份紅麻種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中139對(duì)引物擴(kuò)增出了條帶，通用性比例達(dá)53.5%，128對(duì)引物具有多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例達(dá)49.2%。本研究的通用性比例及多態(tài)性比例雖較武耀龍等[13]的89%和56%要低，但武耀龍等[13]的實(shí)驗(yàn)僅有64對(duì)棉花引物，實(shí)驗(yàn)所用到的引物基數(shù)偏少。本研究利用260對(duì)棉花SSR引物、24份紅麻材料，得到了更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)棉花不同染色體上的SSR引物的擴(kuò)增率和多態(tài)率是不同的， 暗示著棉花和紅麻物種分化后，染色體存在重排現(xiàn)象。這些表明，棉花引物應(yīng)用到紅麻分子標(biāo)記研究中是可行的，也初步證實(shí)了近緣物種間SSR引物是可以通用的。

本研究通過(guò)NTSYS軟件進(jìn)行聚類分析，以遺傳相似系數(shù)0.58為閾值，把24份紅麻種質(zhì)分成2個(gè)類群，其中AfricaLY單獨(dú)一個(gè)類群（Pop1），其他的23個(gè)紅麻種質(zhì)一個(gè)類群（Pop2）。從類群的劃分可以看出，非洲裂葉同其他23份紅麻種質(zhì)之間存在著較大的遺傳差異，而這種差異是因?yàn)榉侵蘖讶~來(lái)源于非洲，其地理來(lái)源同其他種質(zhì)都有較大的差異。而在亞群劃分上，AfricaLY單獨(dú)劃分為亞群Ⅰ；亞群Ⅱ共包含18份種質(zhì)，其中有17份種質(zhì)產(chǎn)地都處于北緯0°～30°，親緣關(guān)系最近的是T19和福紅5號(hào)。德國(guó)的SCS-11-06-1雖然也被劃分在亞群Ⅱ內(nèi)，但聚類圖中顯示其與KD3-2、Taihong-2和722-3親緣關(guān)系稍近，跟亞群Ⅱ其他種質(zhì)親緣關(guān)系仍然較遠(yuǎn)。亞群Ⅲ包含來(lái)自贊比亞的Zanyin No. 1，而福紅952劃分在亞群Ⅱ內(nèi)，這說(shuō)明Zanyin No. 1和福紅952能被被區(qū)分開(kāi)來(lái)。從其地理來(lái)源來(lái)看， Zanyin No. 1是在低緯度國(guó)家贊比亞選育而成的，而福紅952是在亞熱帶地區(qū)福建省選育而成的，所以兩者之間存在較大的差異。課題組前期[20]進(jìn)行的紅麻光周期反應(yīng)敏感度的實(shí)驗(yàn)表明，福紅952光周期反應(yīng)敏感度為56.2%，Zanyin No.1光周期反應(yīng)敏感度為36.0%，進(jìn)一步證實(shí)了這2份種質(zhì)之間存在著較大差異。

本研究通過(guò)棉花SSR分析24份紅麻種質(zhì)的遺傳多樣性，遺傳相似系數(shù)變化為0.35～0.87，與前人研究相比，如陶愛(ài)芬等[16]通過(guò)ISSR對(duì)30份紅麻種質(zhì)進(jìn)行分析得到的遺傳相似系數(shù)0.70～0.95，以及鄭海燕等[21]通過(guò)SRAP對(duì)51份紅麻種質(zhì)進(jìn)行分析得到的遺傳相似系數(shù)0.62～0.99，這24份紅麻種質(zhì)資源之間的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這些體現(xiàn)出，棉花SSR引物對(duì)紅麻進(jìn)行遺傳多樣性分析是可行的，這不僅豐富了紅麻的SSR分子標(biāo)記，而且為紅麻和棉屬的比較基因組學(xué)和遺傳研究提供了依據(jù)。

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