植物病理、作物病蟲害及其防治橡膠樹臭根病菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究

吳如慧　李增平　孫先伊晴　張宇　丁婧鈺　程樂樂

摘 要 利用海南省橡膠樹臭根病病株上采集的病根樣本，采用菌索組織分離法獲得菌落后，進行子實體誘導(dǎo)產(chǎn)生分生孢子，再經(jīng)單孢分離純化獲得菌株HNDZ001，通過柯赫氏法則驗證、形態(tài)學(xué)特征觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對該菌株進行鑒定，確定菌株HNDZ001為引起橡膠樹臭根病的匐燦球赤殼菌（Sphaerostilbe repens Berk.& Br.）。生物學(xué)特性測定結(jié)果表明，菌株HNDZ001在PDA培養(yǎng)基上菌落近圓形，表面黃白色，致密，背面呈深褐色至淺黃色，后期會產(chǎn)生黃褐色菌索和孢梗束；該菌菌絲生長的適宜條件為溫度25～34 ℃、pH 7～9，最適生長條件是溫度28 ℃、pH值為8、甘露醇為碳源、牛肉浸膏為氮源、完全黑暗，且在黃瓜汁培養(yǎng)基上菌絲生長最好。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；臭根??；匐燦球赤殼菌；生物學(xué)特性

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Utilizing the diseased root samples collected from the stinking root rot of rubber tree in Hainan Province， colonies were obtained using the method of rhizomorph tissue isolation， and then the sporocarp was induced to produce conidia. The strain HNDZ001 was obtained by single spore isolation and purification. Based on the Kochs postulates， morphological characteristics and molecular biological technology， the strain HNDZ001 was identified as Sphaerostilbe repens Berk. & Br.， and It was the pathogen causing stinking root rot of rubber tree. The biological characteristics of the strain showed that the colonies were nearly round， yellowish-white and dense on the surface， dark brown to light yellow on the back， and produced yellow brown rhizomorph synnema on the PDA medium； The optimum conditions for mycelium growth were 25-34 ℃， pH 7-9. The optimum growth conditions were 28 ℃， pH 8， mannitol as carbon source， beef extract as nitrogen source， completely dark， and mycelium grew best in cucumber juice agar medium.

Key words rubber tree； stinking root rot； Sphaerostilbe repens； biological characteristic

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.017

橡膠樹根病是影響橡膠樹生長和減產(chǎn)的三大重要病害之一，目前對于進行橡膠樹根病的經(jīng)濟有效防治還是一大難題[1]。國外報道的橡膠樹根病有8種，我國已發(fā)現(xiàn)7種，為害較大的有紅根病、褐根病、臭根病，此外還有紫根病、白根病、黑紋根病、黑根病。1907年首次在錫蘭的膠樹上發(fā)現(xiàn)臭根病[2]。臭根病于低洼積水的膠園易發(fā)生，是一種僅次于褐根病而導(dǎo)致膠樹死亡最快的根病。臭根病因病根會散發(fā)出惡臭而得名，但這種臭氣是由于在潮濕條件下繁殖起來的細(xì)菌使病根腐敗而產(chǎn)生，僅臭根病菌為害則不會產(chǎn)生臭氣[2]。發(fā)病的橡膠樹剝下病根表皮后，在木質(zhì)部的表面和根皮內(nèi)側(cè)都能看到明顯的白色草葉狀菌索，老化的菌索部分轉(zhuǎn)為紅棕色或巧克力色，后期全部變?yōu)楹谏玔3]。水淹、機械損傷或毒殺后的膠樹樹根，都易受臭根病菌的侵染，膠樹染病后，病菌靠根狀菌索生長到鄰近膠樹的根系進行蔓延擴展，不斷加重為害[4]。近年來，在海南、云南種植區(qū)的橡膠樹臭根病發(fā)生有逐年增多的趨勢，且筆者在海南還發(fā)現(xiàn)木菠蘿、龍眼、榕樹等木本植物也有發(fā)生臭根病。對橡膠樹臭根病菌的分離和生物學(xué)特性在國內(nèi)外尚未見有詳細(xì)的研究報道。為了弄清橡膠樹臭根病病菌的侵染過程和發(fā)病規(guī)律，本文從海南省儋州兩院發(fā)生臭根病的橡膠樹病根上取樣，成功分離純化出病原菌后進行了生物學(xué)特性測定，旨在為進一步深入研究該病菌和生產(chǎn)防治臭根病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病樣及接種苗木 于2016年11月從海南省儋州市兩院試驗農(nóng)場沙田隊橡膠園采集帶有白色草葉狀菌索的病根，所采樣本用保鮮袋包裝后帶回實驗室備用。接種所用橡膠苗為海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院學(xué)生教學(xué)基地內(nèi)種植的2年生苗木。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato sugar agar，PSA）培養(yǎng)基、馬鈴薯胡蘿卜瓊脂（potato carrot agar，PCA）培養(yǎng)基、查彼（Czapek）培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂（oat meal agar，OMA）培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂（corn meal agar，CMA）培養(yǎng)基、黃瓜汁（cucumber juice agar，CJA）培養(yǎng)基：黃瓜200 g、瓊脂粉11 g、蒸餾水 1 L；橡膠根汁培養(yǎng)基：橡膠根200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉11 g、蒸餾水1 L；橡膠莖汁培養(yǎng)基：橡膠莖200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉11 g、蒸餾水1 L。參閱方中達(dá)[5]《植病研究方法》和孫廣宇[6]《植物病理學(xué)實驗技術(shù)》配制。

1.1.3 試劑及儀器 E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit、E.Z.N.A. Gel Extraction Kit（100），美國OMEGA公司；2×Taq-Mixture，北京Biomed公司；DNA Marker，大連TaKaRa公司；Olympus BX 51顯微鏡，日本Olympus公司；JY600電泳儀，上海京工實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹臭根病病原菌分離純化 菌索組織分離法：從發(fā)病的病根表皮內(nèi)側(cè)切取約5 mm長的白色草葉狀菌索，在75%乙醇溶液中浸泡6～8 s，再用1%的升汞溶液浸泡1 min，然后用滅菌水沖洗4次，用無菌吸水紙吸干，接種到PDA培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌絲后進行純化，轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基平板上保存?zhèn)溆谩?/p>

單孢分離法：待分離菌在PDA培養(yǎng)基平板上長出根狀菌索和孢梗束后，用滅菌的接種環(huán)從孢梗束頂端的乳白色分生孢子球上挑取少量分生孢子，置于1 mL滅菌水中混勻后，進行3次梯度稀釋成不同濃度的孢子懸浮液，用滅菌的玻璃涂棒分別粘取不同稀釋度的孢子懸浮液涂布在PDA培養(yǎng)基平板表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d后挑取單孢菌落進行純化，獲得的純化菌株編號為HNDZ001。

1.2.2 菌株的致病性測定 離體接種取6段直徑約1.5 cm粗，8～20 cm長的黃白色新鮮橡膠樹健康根段，4段根接分離菌，兩段根接空白PDA培養(yǎng)基作對照；活體接種選取6株齡期為1年生的熱研7-33-97健康橡膠樹袋裝苗，3株接HNDZ001分離菌，3株接空白PDA培養(yǎng)基作對照。先在待接種植株的莖干基部或根段表面噴70%酒精進行消毒，待酒精風(fēng)干后用滅菌手術(shù)刀在消毒的植株莖干表面間隔5 cm左右削出2～3個長約1 cm的平面?zhèn)?，用無菌接種環(huán)挑取帶根狀菌索的菌絲塊，菌絲面朝下接種在傷口上，表面覆蓋無菌水濕潤的棉花后包裹保濕，每2 d觀察一次，定期記錄發(fā)病情況并拍照。

1.2.3 菌株的鑒定 形態(tài)鑒定：將分離菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)12 d后，觀察菌落形態(tài)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察和測量病菌的孢梗束和分生孢子并拍照。分子鑒定：菌株培養(yǎng)12 d后收集100 mg菌絲，使用OMEGA Fungal DNA Kit來提取DNA。采用通用引物 ITS1（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對所提取DNA的rDNA-ITS 片段進行PCR擴增[7]，引物合成由華大基因（深圳）生物科技有限公司完成。擴增產(chǎn)物在恒壓150 V下用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用OMEGA Extraction Kit試劑盒切膠回收目的片段，純化后送華大基因（深圳）生物科技有限公司測序。將測序獲得的ITS序列在NCBI上進行BLAST比對分析，并提交序列，利用MEGA 5.0軟件以鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 橡膠樹臭根病病原菌的生物學(xué)特性測定 用直徑6 mm的打孔器在菌齡一致（12 d）的培養(yǎng)菌落邊緣打取菌餅備用，分別將菌餅接到不同種類的培養(yǎng)基平板中心，觀察菌落的生長情況。待最優(yōu)條件下的菌絲生長到接近培養(yǎng)皿邊緣時（約12 d后）取出，并用十字交叉法測量菌落直徑。每組不同處理設(shè)置3個重復(fù)。

除不同培養(yǎng)基及碳、氮源生物學(xué)測定外，其他條件所使用的培養(yǎng)基均為CJA培養(yǎng)基。（1）培養(yǎng)基：選用橡膠根汁、橡膠莖汁、PDA、PCA、PSA、Czapek、OMA、CMA、CJA共9種不同培養(yǎng)基，接菌后置于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。（2）溫度：測定條件為10、15、20、25、26、28、30、32、34、36、38、40 ℃共12個梯度，接菌后置于不同溫度下恒溫黑暗培養(yǎng)。（3）光照：采用15 W照明燈，測定條件設(shè)置為24 h全光照、24 h全黑暗、12 h光照與12 h黑暗交替3種條件，28 ℃恒溫培養(yǎng)。（4）pH值：用1 mol/L 的HCl和1 mol/L的NaOH溶液將已滅菌的CJA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13共11個梯度，3組重復(fù)接菌餅進行測定。（5）碳、氮源：分別稱取等質(zhì)量的葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉、α-乳糖、肌醇、丙三醇、甘露醇、D-山梨醇作為碳源；稱取等質(zhì)量的酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉膏、草酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈣、硝酸鈉、硝酸鉀作為氮源；分別替換Czapek培養(yǎng)基中的碳、氮源，設(shè)3組重復(fù)接菌餅進行測定。將不加碳源、氮源的Czapek培養(yǎng)基作為缺碳、缺氮空白對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010和SAS 9.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncants multiple range test進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹臭根病癥狀和田間發(fā)病特點

發(fā)生臭根病的橡膠樹初期整株葉片和嫩枝在短期內(nèi)迅速失水、失綠萎垂，繼而逐漸變褐，小枝干枯，葉片脫落后，大枝條和莖干繼續(xù)失水，樹皮干縮，1個多月后整株徹底枯死（圖1-A～C）。發(fā)病初期的病根表皮呈灰褐色，不粘泥沙，用水較易洗掉，樹干基部表皮和樹根表皮組織水浸狀濕腐，易與木質(zhì)部分離，木質(zhì)部表面與表皮內(nèi)側(cè)組織呈暗灰白色，散發(fā)出難聞的糞便臭味（圖1-D）。條件適宜時在病根表面長有灰白色菌膜，緊貼表皮下的菌膜呈黃白色，木質(zhì)部表面和表皮內(nèi)側(cè)長出扁而粗的白色羽毛狀菌索，菌索增粗后聯(lián)合成草葉狀，后期草葉狀菌索變成紅褐色或黑褐色（圖1-E～H）。

2.2 致病性測定

單孢分離純化的橡膠樹臭根病菌HNDZ001菌株在活體橡膠樹根莖部接種12 d后能造成接種部位的莖干基部組織呈褐色，散發(fā)有臭味，并伴有孢梗束的產(chǎn)生，與田間自然發(fā)病的癥狀相似；對照皮下組織白色，未被侵染。帶菌索的菌絲塊接種在離體的橡膠樹根段上5 d后，接種部位的橡膠根表變褐色，旁邊長出孢梗束，對照無變化。切取接菌后發(fā)病的植物病部組織進行再分離，重新分離獲得形態(tài)相同的菌株，表明用于接種的分離菌為致病菌（圖2）。

2.3 橡膠樹臭根病病菌形態(tài)

菌株HNDZ001在PDA培養(yǎng)基上生長的菌落呈圓形，菌落初期呈白色，繼而變黃白色，菌絲致密，后期逐漸變?yōu)闇\黃色，背面中央的顏色逐漸變?yōu)殚冱S色（圖3-a）。在PDA培養(yǎng)基上有時在菌落中伴隨有褐色根狀菌索的產(chǎn)生，根狀菌索緊貼培養(yǎng)基匍匐生長，直徑為2.0～3.5 mm，菌索先端呈明顯的二叉狀分枝，在根狀菌索上長有直立生長的粉紅色棍棒狀孢梗束，后期變紅褐色（圖3-b）；孢梗束大小為（322.85～1 880.87） μm×（69.65～618.03） μm（平均650.97 μm×183.85 μm），孢梗束上部分生孢子梗分散呈花束狀，眾多分生孢子梗頂端產(chǎn)生的分生孢子和膠質(zhì)物一起粘結(jié)形成球形或扁球形、乳白色、略透明的分生孢子球，內(nèi)含大量分生孢子；孢子球大小為（175.20～601.08） μm×（190.70～850.17） μm（平均403.26 μm×409.70 μm）（圖3-c～d）；分生孢子產(chǎn)生于分生孢子梗頂端，單胞，無色，卵圓形，兩端略尖，內(nèi)含1～2個油球；分生孢子大小為（10.7～22.8） μm×（4.4～9.4） μm（圖3-e～f）。在菌絲上可產(chǎn)生大量黃褐色球形的厚垣孢子，大小為（10.24～14.94） μm×（9.354～14.55） μm（圖3-g）。

2.4 橡膠樹臭根病病原菌的分子鑒定

對病原菌進行ITS-PCR擴增，獲得1條550 bp左右的清晰條帶。測序顯示該菌的rDNA-ITS片段大小為544 bp（MG230794），將該序列在NCBI上BLAST比對，選取巨孢赤殼菌（Cosmospora gigas）、Corallomycetella elegans、藤倉赤霉菌（Gibberella fujikuroi）等9株菌株，進行多重序列比較及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示該病原菌的rDNA-ITS序列與匐燦球赤殼菌（KM231828）的同源性達(dá)99%，表明該病原菌HNDZ001與匐燦球赤殼菌遺傳距離最小，聚為一類（圖4）。結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與rDNA-ITS序列分析結(jié)果，將該病原菌鑒定為匐燦球赤殼菌[Sphaerostilbe repens Berk.&Br.= Corallomycetella elegans Berk. & Curt ]。

2.5 橡膠樹臭根病病菌的生物學(xué)特性

2.5.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 橡膠樹臭根病病菌HNDZ001在供試的9種培養(yǎng)基上均能生長，但只有PDA培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)出根狀菌索和孢梗束。在橡膠根汁、橡膠莖汁培養(yǎng)基上長勢雖快但是菌落稀薄，菌絲絮狀；在CJA、Czapek、CMA、PSA、PDA培養(yǎng)基上菌絲致密，長勢很好，菌絲淡黃至黃褐色，除CJA培養(yǎng)基外，其他都有同心輪紋；在PCA和OMA培養(yǎng)基上長勢一般，菌絲較稀薄，有同心輪紋，菌絲白色至淡黃色（圖5）。表明CJA培養(yǎng)基最適合橡膠樹臭根病病菌生長，而PDA培養(yǎng)基則可誘導(dǎo)出根狀菌索和孢梗束（圖3-b）。

2.5.2 pH對菌絲生長的影響 橡膠樹臭根病病菌HNDZ001在pH4～13范圍內(nèi)菌絲均能生長，pH 4時生長緩慢，pH 5～8時菌絲生長速率增快，pH 8時菌落直徑極顯著高于其它處理，表明pH8最適宜菌絲生長，pH 8～13與pH 4處理間菌落直徑差異顯著（圖6），表明橡膠樹臭根病病菌在中性至堿性環(huán)境中生長要比在酸性環(huán)境中好。

2.5.3 光照對菌絲生長的影響 橡膠樹臭根病病菌HNDZ001在連續(xù)光照、12 h光暗交替、完全黑暗3種光照條件下均能生長，但3種處理下菌絲生長狀況差異比較明顯，完全黑暗條件下病原菌菌絲生長速度最快，連續(xù)光照條件下菌絲生長速度最慢。由此可見，光照對橡膠樹臭根病病菌的菌絲生長有抑制作用（圖7）。

2.5.4 溫度對菌絲生長的影響 橡膠樹臭根病病菌HNDZ001在15～38 ℃溫度范圍內(nèi)均能生長，40 ℃停止生長，但病原菌未死亡，將其轉(zhuǎn)移至合適溫度仍可繼續(xù)生長；適宜的生長溫度為25～32 ℃，最適生長溫度為28 ℃（圖8）。

2.5.5 碳、氮源對菌絲生長的影響 從表1可知，橡膠樹臭根病病菌菌絲對不同的碳源或者不同種類的同類型碳源的利用率存在差異。橡膠樹臭根病病菌HNDZ001在供試的12種碳源培養(yǎng)基上均能生長，其中在以甘露醇為碳源的菌落直徑最大，菌絲致密，絮狀，深褐色，其次為肌醇、D-山梨醇和甘油，在D-木糖和葡萄糖中菌落直徑最小，且在D-木糖中菌落稀薄，碳源的利用率低。

從表2可知，病原菌對不同的氮源利用率存在差異。橡膠樹臭根病病菌HNDZ001在供試的11種氮源培養(yǎng)基上均能生長，單一氮源以硝酸鈣為氮源的菌落直徑最大，其次為硝酸鈉。草酸銨為氮源的菌落直徑最小。在缺氮元素的培養(yǎng)基中，雖然菌落直徑最大，但是菌絲稀薄，幾乎近透明狀。復(fù)合氮源中牛肉浸膏菌落直徑最大，菌落圓形，中央深褐色，邊緣淡黃色，致密，有同心輪紋。

3 討論

海南橡膠樹臭根病在田間主要發(fā)生于7～9月間的多雨季節(jié)，在膠園中低洼易積水處的膠樹易發(fā)病，被土掩埋過深或近溝邊被水浸泡根系的膠樹也易發(fā)病，有單株發(fā)病，死亡后不再傳播擴展，也有單株發(fā)病后通過土壤中病根上的菌膜和菌索蔓延到鄰近膠樹上的根系上侵染而擴展形成3～7株染病后枯死的較大病區(qū)，但不會像紅根病或褐根病形成幾十株甚至百株以上的大病區(qū)。

本研究發(fā)現(xiàn)臭根病菌形態(tài)特征與報道的匐燦球赤殼菌（Sphaerostilbe repens）相同[8]。已有報道匐燦球赤殼菌（Sphaerostilbe repens B.etBr.=Corallomyces elegans Berk.&Curt=Corallomycetella elegans Berk.&Curt）[9-13]是引起中非的大部分地區(qū)（尤其是剛果）木薯白根病害的主要病原菌。該病最早在斯里蘭卡的番木瓜上首次報道，隨后發(fā)現(xiàn)在馬來西亞的柑橘、木槿、芒果、木薯和鱷梨上均有發(fā)生；在非洲，烏干達(dá)、科特迪瓦、加納和扎伊爾的橡膠樹上均發(fā)現(xiàn)該病害[14]；在剛果，匐燦球赤殼菌也會侵染甘薯的塊莖并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[15]。孢梗束和根狀菌索緊密結(jié)合在一起形成一個聚合體，這個聚合體在匐燦球赤殼菌的侵染過程中發(fā)揮重要的作用[16]。本研究利用橡膠樹臭根病新鮮病根上產(chǎn)生的菌索進行分離，在PDA培養(yǎng)基上形成菌索、孢梗束和分生孢子孢囊束和分生孢子梗后進行單孢分離純化，結(jié)果顯示橡膠樹臭根病病原菌在黑暗條件下有利于其生長，光照對其生長存在抑制作用；黃瓜汁培養(yǎng)基最適合該菌生長；該菌菌絲生長適宜溫度25～34 ℃，最適溫度28 ℃；適宜的pH值范圍7～9，pH8時最適菌絲生長；以甘露醇為碳源的菌落長勢最好；單一氮源以硝酸鈣為氮源的菌落長勢最好，復(fù)合氮源以牛肉浸膏為氮源長勢最好。研究表明，橡膠樹臭根病在田間可由氣流傳播分生孢子從根莖傷口處侵入引起發(fā)病，條件適宜時，發(fā)病植株也可由病根上產(chǎn)生的菌膜和菌索蔓延到健根上擴展傳播為害鄰近膠樹，形成小病區(qū)。防止橡膠樹頭長期積水可減少此病的發(fā)生。

對于橡膠樹臭根病，盡管在世界很多植膠國家都有發(fā)生，但是相關(guān)研究較少，對病原菌的鑒定、生物學(xué)特性以及病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律等內(nèi)容的研究尚不夠全面，在我國也未見相關(guān)報道。本研究首次采用菌索組織分離法獲得純化菌落后，進行子實體誘導(dǎo)產(chǎn)生分生孢子，再經(jīng)單孢分離純化獲得單孢菌株，并進行了相關(guān)生物學(xué)特性和致病性測定，完成了柯赫法則驗證，補充了這一方面的研究空白。今后可進一步深入開展臭根病菌的有性態(tài)的誘導(dǎo)及發(fā)病規(guī)律等相關(guān)研究。

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