頭花蓼種子生活力TTC法最優(yōu)測定條件研究

王志威 魏升華 李俊 嚴福林 魏怡冰 杜富強 鄧嬌

摘 要 試驗研究用四唑染色法（TTC法）測定頭花蓼（Polygonum capitatum）種子活力的最優(yōu)條件。以染色溫度、染色時間和TTC染色濃度為指標，通過單因素試驗、正交試驗、響應(yīng)面試驗對頭花蓼種子活力測定的最優(yōu)條件進行研究。結(jié)果：染色溫度40 ℃、染色時間180 min和TTC濃度20 mmol·L-1為頭花蓼種子活力測定的最優(yōu)條件；三個檢測指標對種子活力測定影響的大小順序為染色溫度>染色時間>TTC染色濃度。認為TTC法是一種測量頭花蓼種子活力的有效方法，能夠快速客觀評價頭花蓼種子的發(fā)芽能力，為預(yù)測其播種量和出苗率提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 頭花蓼；種子生活力；TTC染色法；最優(yōu)測定條件

中圖分類號：S339.3+1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.25.001

頭花蓼（Polygonum capitatum），又稱石莽草、石辣蓼、四季紅[1-2]，是蓼科蓼屬的多年生匍匐草本植物，入藥為其地上部分或干燥全草[3-4]。其味苦、辛，性涼；歸腎、膀胱經(jīng)；功效清熱利濕，解毒止痛，活血散瘀，利尿通淋；主治痢疾、膀胱炎、尿路結(jié)石、腎盂腎炎等[5-6]。頭花蓼是我國西南地區(qū)民間常用傳統(tǒng)中草藥，也是該地區(qū)一種極為重要的苗藥[7-9]，在治療泌尿系統(tǒng)疾病等疾患上具有獨特的療效，目前是貴州威門藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品“熱淋清顆粒”的原藥材，同時也是“熱清淋膠囊”“四季草顆?！焙汀懊诹苣z囊”等的原材料[10-15]。頭花蓼除了藥用之外，因其植株覆蓋力較強，成片生長時觀賞性很好，故也是一種具有較大開發(fā)前景的觀賞性地被植物[16-18]。

近年來，有關(guān)頭花蓼的研究報道很多，但主要集中在其化學(xué)成分與藥理作用研究上。如張麗娟等（2012）對頭花蓼的黃酮類成分進行了研究，結(jié)果表明，頭花蓼中的黃酮類成分可能與其抗菌、抗炎活性相關(guān)，是頭花蓼的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[19]；程欣霞等（2010） 采用高速逆流色譜技術(shù)對頭花蓼水提粉末的正丁醇粗提取物進行了分離純化，首次報道在頭花蓼中分離得到短葉蘇木酚酸[20]。

隨著頭花蓼中有效化學(xué)成分的大量發(fā)現(xiàn)及相關(guān)產(chǎn)品的大量開發(fā)，頭花蓼的市場需求也逐年增加，目前已逐漸從依賴野生資源采集轉(zhuǎn)為規(guī)范化和規(guī)?；N植[21]。由于種子種苗的質(zhì)量是藥材產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要基礎(chǔ)和前提[22]，因此頭花蓼種子的質(zhì)量在種植過程中起著至關(guān)重要的作用。盡管發(fā)芽率是檢測種子質(zhì)量的重要指標，但實踐證明頭花蓼的發(fā)芽時間較長，此法不能很好地滿足實際生產(chǎn)需要。四唑染色法（TTC染色法），是一種可快速測定種子活力的化學(xué)方法，是種子生產(chǎn)和貿(mào)易中的重要技術(shù)[23-25]。本研究使用TTC染色法，通過單因素試驗、正交試驗和響應(yīng)面試驗，對頭花蓼種子活力測定的最優(yōu)條件進行探討，以期為快速客觀評價頭花蓼種子的發(fā)芽能力、預(yù)測其播種量和出苗率提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

頭花蓼種子樣品于2016年9月采自貴州威門藥業(yè)股份有限公司頭花蓼資源圃，置于貴陽中醫(yī)學(xué)院種子庫4 ℃常溫庫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

2，3，5-氯代三苯基四氮唑，磷酸二氫鈉，氫氧化鈉，去離子水。

1.3 種子預(yù)處理方法

1.3.1 浸泡

挑選凈種子，將其放在奧林巴斯連續(xù)變倍體視顯微鏡下，用鑷子與解剖刀將種子的兩端切去一部分，使其胚兩端露出，之后將其放于置有濾紙的培養(yǎng)皿中，加去離子水浸泡種子，加水量以剛好沒過種子為宜，浸泡30 min使其吸脹后取出，將種子挑至另一置有濾紙的培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿中放50粒種子，供染色用。

1.3.2 染色

在每個培養(yǎng)皿加入不同濃度的TTC溶液，溶液量以沒過種子為度，分別置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中避光染色，達到預(yù)設(shè)時間后取出，用去離子水沖洗后將種子放于濾紙上，根據(jù)種子染色面積的大小和程度判斷種子的活力。此外，另取50粒種子置于沸水中煮15 min后取出，并依據(jù)相同條件進行染色，作為對照組。每個處理重復(fù)3次。

1.4 種子活力最優(yōu)測定條件試驗

1.4.1 單因素試驗

染色溫度：取頭花蓼種子50粒，TTC濃度為10 mmol·L-1，染色時間為60 min，分別置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃溫度下染色，測定種子活力。

染色時間：取頭花蓼種子50粒，TTC濃度為10 mmol·L-1，染色溫度為30 ℃，染色時間分別為30 min、60 min、120 min、180 min、210 min，測定種子活力。

TTC濃度：取頭花蓼種子50粒，染色溫度為30 ℃，染色時間為60 min，分別置于濃度為5， 10， 15， 20， 25 mmol·L-1的TTC溶液中進行染色，測定種子活力。

1.4.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇染色溫度（A）、染色時間（B）和染色濃度（C）三個因素，每個因素三個水平，每組50粒頭花蓼凈種子，因素水平設(shè)定見表1。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以染色溫度（A）、染色時間（B）、染色濃度（C）三因素為變量，以種子染色率（R）為響應(yīng)值，根據(jù)Central-Composite中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素五水平的響應(yīng)面試驗（見表2），每組50粒頭花蓼凈種子。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0和Design Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由表3可知，頭花蓼種子的著色率隨著溫度的升高而升高，但從40 ℃以后著色率的增加趨于平緩，因此最適染色溫度在40 ℃左右；由表4可知，頭花蓼種子的著色率隨染色時間的增加而升高，當染色時間達到180 min時，種子著色率最高，當染色時間再增加時，種子著色率反而降低，因此最佳染色時間在180 min左右；由表5可知，頭花蓼種子著色率隨著濃度的升高而升高，但從染色濃度20 mmol·L-1之后著色率的增加趨于平緩，因此最適染色濃度在20 mmol·L-1左右。

2.2 正交試驗結(jié)果

由表6可知，頭花蓼種子活力最高（82%）的處理組合為：染色溫度40 ℃，染色時間180 min，TTC濃度20 mmol·L-1；種子活力最低（8%）的組合為：染色溫度30 ℃，染色時間60 min，TTC濃度10 mmol·L-1。方差分析結(jié)果（表7）顯示，染色溫度、染色時間和TTC濃度差異均不顯著，從三因素的P值及F值的大小可知，三因素對頭花蓼種子活力測定影響力大小順序為染色溫度>染色時間>TTC濃度。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 模型的建立

用Design Expert 8.0.6軟件中的Central Composite Design對頭花蓼種子活力測定響應(yīng)面試驗結(jié)果（見表8）進行多元回歸分析，得回歸方程為：

R=55.71+22.79a+18.03b+7.07c-4.00ab-5.50ac+10.00bc-3.42a2-8.01b2-2.35c2 （1）

方程（1）方差分析結(jié)果（見表9）：F=39.79，且P<0.000 1，表明模型具有極顯著性差異，在整個被研究的回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好。模型的決定系數(shù)為0.972 8，說明模型可以解釋響應(yīng)值90.5%種子活力的變化，調(diào)整決定系數(shù)為0.948 4，與決定系數(shù)相差很小，表明模型擬合度高。模型的變異系數(shù)為13.71%（<15%），表明試驗具有可信度和精確度；試驗的信噪比為21.334（>4），較為合理，適用于頭花蓼種子活力測定優(yōu)化試驗。模型系數(shù)的顯著性檢驗表明，a、b、c、bc、b2各項具有極顯著性，ac項具有顯著性，且三因素對頭花蓼種子活力測定的影響順序為染色溫度>染色時間>染色濃度，進一步支持了正交試驗的結(jié)論。

2.3.2 響應(yīng)面分析及最佳優(yōu)化條件的確定

響應(yīng)面分析能直觀體現(xiàn)兩個因素交互作用對種子活力的影響，響應(yīng)面的坡度越陡，則兩個因素的交互作用對種子活力響應(yīng)值的影響越顯著。由圖1可知，染色溫度和染色時間交互作用時響應(yīng)面的坡度最陡，其次是染色溫度和染色濃度，最后是染色時間和染色濃度，這進一步支持了正交試驗中的“三因素對頭花蓼種子活力測定值影響順序為染色溫度>染色時間>染色濃度”的結(jié)論。用Design Expert 8.0.6軟件中的Central Composite Design分析，得出頭花蓼種子最優(yōu)測定條件為：染色溫度40 ℃，染色時間180 min，染色濃度20 mmol·L-1，此預(yù)測的條件與正交試驗的結(jié)果一致。

3 結(jié)論和討論

采用TTC染色法對常用苗藥頭花蓼的種子進行了活力最優(yōu)測定條件研究，總結(jié)和討論于下。

1）染色溫度、染色時間和TTC染色濃度均為活力測定的關(guān)鍵因素，三者中的某一者或二者互作均會對頭花蓼種子活力測定產(chǎn)生影響。類似的情況同樣存在于其他藥用植物種子活力TTC法測定的研究結(jié)果中，如：張瑜等（2013）對豬屎豆種子進行TTC染色的研究發(fā)現(xiàn)，TTC濃度、染色溫度和染色時間影響豬屎豆種子的染色效果[26]；成小璐等（2016）對羊耳菊的種子活力測定發(fā)現(xiàn)，TTC濃度、染色溫度和染色時間為羊耳菊種子活性的三條重要檢測指標[24]。

2）三因素對頭花蓼種子活力測定影響的大小順序為染色溫度>染色時間>TTC濃度。從實際生產(chǎn)需要出發(fā)，由于TTC和溫度都存在價格成本，因此可依據(jù)本文中的結(jié)論，適當降低染色溫度或TTC濃度，而通過延長染色時間從而達到節(jié)約成本的目的。

3）本研究同時運用正交法和相應(yīng)面法結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)論均表明，頭花蓼種子活力TTC測定的最優(yōu)條件為：染色溫度40 ℃，染色時間180 min，TTC濃度20 mmol·L-1。響應(yīng)面法能考察各因素間的相互作用，精密度較高，在研究上和正交試驗一起使用，可彌補正交試驗的不足。如：在優(yōu)化丹參提取工藝時，李紹林等[27]用正交法，以提取次數(shù)、提取時間、醇濃度和溶媒量作為考察因素，發(fā)現(xiàn)只有提取次數(shù)對結(jié)果具有顯著性影響；而黃元紅等[28]用響應(yīng)面法得到4個因素影響均較顯著，并結(jié)合回歸方程和響應(yīng)面結(jié)果最終確定其最佳工藝條件。成小璐等（2016）[24]對羊耳菊種子活性的TTC法檢測研究發(fā)現(xiàn)，和正交試驗法相比較，響應(yīng)面分析法在試驗設(shè)計和結(jié)果表達方面更加優(yōu)良，能進一步確定并彌補正交試驗的結(jié)果。因此，筆者認為，在種子活力TTC法檢測的過程中，為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果的科學(xué)性，可同時考慮運用正交法和響應(yīng)面法。

參考文獻：

[1] 魏升華，馮中寶，陳華，等.苗藥頭花蓼種植適宜區(qū)分析及GAP基地選建[J].中國現(xiàn)代中藥 2014，16（11）：921-924.

[2] 楊燁，王祥培，吳紅梅，等.苗藥頭花蓼藥材的植物資源分布及品種情況研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2012，18（7）：33-34.

[3] 吳林菁，王祥培，吳紅梅，等.苗藥頭花蓼及其易混品的紫外譜線組法鑒別研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2012，18（8）：70-71.

[4] 黃建軍.頭花蓼蟲害的發(fā)生與防治[J].科學(xué)種養(yǎng)，2013（4）：30.

[5] 陳芳，汪毅，杜江.貴州民族藥物研究及開發(fā)現(xiàn)狀[J].中國民族民間醫(yī)藥，2013，22（6）：1-2.

[6] 胡楠，唐仕歡，成龍.苗藥頭花蓼及克淋通膠囊組方的臨證解析[J].中國中藥雜志，2014，39（7）：1318-1320.

[7] 張小波，周濤，郭蘭萍，等.基于地形因子的貴州省頭花蓼生態(tài)適宜性等級劃分[J].中國中藥雜志，2011，36（3）：311-315.

[8] 馮果，劉文，吳增光.貴州苗藥頭花蓼有效成分及質(zhì)量控制研究進展[J].微量元素與健康研究，2016，33（2）：74-75.

[9] 李孟林，梁斌，姚強，等.苗藥——頭花蓼研究綜述[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2005，5（6）：383-384.

[10] 魏升華，張麗麗，徐亮，等.苗藥頭花蓼種質(zhì)資源收集保存與優(yōu)良種源篩選研究[J].微量元素與健康研究，2015，32（1）：1-3.

[11] 羅霞.熱淋清顆粒：中藥現(xiàn)代化系列報道之八——熱淋清顆粒奇特療效：泌尿系感染經(jīng)驗治療首選藥物[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2007（5）：335.

[12] 孫長生，梁斌，王傳芳.頭花蓼研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥，2005，7（4）：26-28.

[13] 王愛民，鄢艷，譚安菊，等.四季草顆粒質(zhì)量標準提升研究[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，36（5）：455-459.

[14] 陳騫，潘媛銘.解熱清淋膠囊質(zhì)量標準研究[J].醫(yī)藥前沿，2013（30）：131-133.

[15] 曹芳，譚輝，鄧先擴.頭花蓼化學(xué)成分及其黃酮類化合物含量的研究進展[J].黔南民族醫(yī)專學(xué)報，2012，25（2）：121-125.

[16] 陳霜，馬躍.大巴山的六種野生藥用花卉植物[J].南方農(nóng)業(yè)，2014，8（31）：26-28.

[17] 吳宗萍.頭花蓼耐蔭及抗旱生理研究[D].重慶：西南大學(xué)，2010.

[18] 鐘業(yè)聰.頭花蓼——一種理想的野生覆蓋植物[J].植物雜志，2001（6）：16-17.

[19] 張麗娟，王永林，王珍，等.頭花蓼活性組分化學(xué)成分研究[J].中藥材，2012，35（9）：1425-1428.

[20] 陳欣霞，張麗艷，萬金志，等.高速逆流色譜同時分離頭花蓼中的沒食子酸和短葉蘇木酚酸[J].中國中藥雜志，2010，35（15）：1957-1960.

[21] 黃嵐.熱淋清顆粒：中藥現(xiàn)代化系列報道之七——貴州威門藥業(yè)建成國內(nèi)首個頭花蓼GAP規(guī)范化種植基地[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2007，7（4）：313.

[22] 李隆云，彭銳，李紅莉，等.中藥材種子種苗的發(fā)展策略[J].重慶中草藥研究，2011，35（1）：247-252.

[23] 沈宇峰，王志安，俞旭平，等.白術(shù)種子生活力測定方法及其與發(fā)芽率的相關(guān)性研究[J].中國中藥雜志，2008，33（3）：248-250.

[24] 成小璐，魏怡冰，魏升華，等.羊耳菊種子生活力的最佳測定條件[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：100-104.

[25] 邊子星，顏彩燕，姚肖健，等.瀕危華石斛種子活力測定方法研究[J].熱帶作物學(xué)報，2017，38（3）：403-407.

[26] 張瑜，虞道耿，白昌軍.TTC法測定豬屎豆種子生活力的研究[J].草業(yè)與畜牧，2013（1）：19-22.

[27] 李紹林，張建軍.丹參提取工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（12）：45-47.

[28] 黃元紅，衛(wèi)天喜，張發(fā)生，等.星點設(shè)計——效應(yīng)面法優(yōu)選丹參提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（17）：28-31.

（責任編輯：丁志祥）