HPLC法測(cè)定保健食品中葉黃素含量

周立梅 楊磊 張金秋

摘要 [目的]建立改良的HPLC-C18法測(cè)定保健食品中葉黃素含量。[方法]優(yōu)化樣品前處理方法，通過(guò)單因素考察對(duì)破囊溶劑種類、破囊時(shí)間、提取時(shí)間、提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，采用常規(guī)HPLC-C18分析方法進(jìn)行測(cè)定。色譜條件為：流動(dòng)相甲醇，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)446 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。[結(jié)果]葉黃素在0.139 6～2.094 0 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為99.55%， RSD為2.21%。[結(jié)論]改良后的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，所用試劑綠色環(huán)保，可用于保健食品中葉黃素含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜；保健食品；葉黃素；含量測(cè)定

中圖分類號(hào) TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）20-0164-03

Abstract [Objective]The research aimed to establish an improved HPLCC18 method for the determination of lutein in health foods.[Method]Optimization of sample pretreatment method，using single factor to optimize in four aspects，the type of solvent to splitting microcapsules，time of splitting microcapsules，time of extraction and solvent extraction.The extractive was analyzed by conventional HPLCC18.HPLC conditions：mobile phase was methanol，mobile phase rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was 446 nm，oven temperature was 30 ℃，injection volume was 20 μL.[Result]Lutein had good linear relationship within the range of 0.139 6-2.094 0 μg/mL，the average recovery was 99.55%，the RSD was 2.21%.[Conclusion]The improved method is easy to operate，accurate and stable，the solvent is environment friendly for quantitative analysis of lutein from the health food.

Key words HPLC；Health food；Lutein；Determination of content

葉黃素屬于含氧類胡蘿卜素，主要存在于深綠色蔬菜（菠菜、羽衣甘藍(lán)等）、蛋黃、玉米、柑橘類等水果中，人體不能直接合成。越來(lái)越多流行病學(xué)和臨床試驗(yàn)表明，膳食或血清中較高含量的葉黃素可降低眼部疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[1]。作為生理活性物質(zhì)，葉黃素在醫(yī)學(xué)和功能食品領(lǐng)域具有廣闊的研究開發(fā)前景[2]。

目前，利用HPLC法測(cè)定保健食品中葉黃素含量的方法有2種，一種是以C30為分離色譜柱的測(cè)定方法[3]，另一種是黨亞敏等[4]以C18為分離色譜柱的測(cè)定方法，其中C30分離色譜柱使用不廣泛。測(cè)定葉黃素的色譜條件相對(duì)成熟，但是樣品處理方法很多，如無(wú)水乙醇超聲提取法[4]、石油醚超聲提取法[5]、水提正己烷—乙酸乙酯萃取法[6]等。為保證樣品中葉黃素被充分提取，該研究在優(yōu)化破囊溶劑、提取溶劑和提取時(shí)間的基礎(chǔ)上，采用HPLC-C18法測(cè)定保健食品中葉黃素含量。

1 材料與方法

1.1 試材

葉黃素原料，荷蘭帝斯曼集團(tuán)；樣品來(lái)源于吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司；葉黃素對(duì)照品，Sigma公司；甲醇，色譜純，F(xiàn)isher Scientific；其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 UitiMate3000液相色譜儀，ACE C18色譜柱，美國(guó)ACE公司；ULtra-6100紫外可見分光光度計(jì)，北京普源精電科技有限公司；AB135-S電子天平，梅特勒-托利多集團(tuán)公司；SB-1200D型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件。ACE C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇，流速為1.0 mL/min，葉黃素檢測(cè)波長(zhǎng)為446 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取5 mg（精確至0.01 mg）葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，以0.1%BHT（二丁基羥基甲苯）乙醇溶液溶解并定容至100 mL。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液充氮避光置于-20 ℃或以下的冰箱中可保存6個(gè)月。

1.3.3 樣品溶液的制備。精密稱取樣品0.1 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入60 ℃水5 mL，超聲處理3 min，取出，放冷，加入0.1% BHT乙醇溶液至接近刻度，未定容，繼續(xù)超聲處理10 min，取出，放冷，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，搖勻。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，供液相測(cè)定[7]。

1.3.4 單因素試驗(yàn)。

1.3.4.1 破囊溶劑的選擇。在檢測(cè)微膠囊型葉黃素的過(guò)程中，至關(guān)重要的一點(diǎn)是對(duì)待檢樣品進(jìn)行前處理，根據(jù)文獻(xiàn)和相關(guān)資料[4，7-8]，對(duì)N，N—二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、60 ℃水3種破囊溶劑進(jìn)行考察。精密稱取樣品0.1 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入60 ℃水5 mL，超聲處理5 min，取出，放冷，加入無(wú)水乙醇至刻度，搖勻。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，供液相測(cè)定。

1.3.4.2 破囊時(shí)間的選擇。因本品所用原料為葉黃素微囊，破囊時(shí)間的確定對(duì)含量測(cè)定十分必要，該研究分別考察了破囊時(shí)間為3、5、7 min時(shí)原料和樣品的含量。

1.3.4.3 提取時(shí)間的選擇。為保證樣品中葉黃素溶出后被充分提取，需對(duì)葉黃素的提取時(shí)間進(jìn)行了考察。分別考察了提取時(shí)間為5、10、15 min時(shí)原料和樣品的含量。

1.3.4.4 提取溶劑的選擇。在參考文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上，分別對(duì)提取溶劑0.1%BHT無(wú)水乙醇溶液和無(wú)水乙醇進(jìn)行考察，在0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定葉黃素含量。

1.3.5 方法學(xué)考察。

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍。從葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中準(zhǔn)確移取0.05、0.10、0.20、0.40、1.00 mL溶液至5個(gè)25 mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，得到濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、2.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液充氮避光置于-20 ℃或以下的冰箱中可保存1個(gè)月。在“1.3.1”色譜條件下，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.2 精密度試驗(yàn)。精密吸取“1.3.4.1”項(xiàng)下方法制備的含葉黃素0.4 μg/mL的對(duì)照品溶液20 μL，按“1.3.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。

1.3.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取樣品6份，按“1.3.3”項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，在“1.3.1”色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定樣品中葉黃素的含量。

1.3.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一樣品溶液，于制備后的0、2、4、8、12、24 h，在“1.3.1”色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。

1.3.5.5 加樣回收率試驗(yàn)。分別精密稱取6份已知含量的樣品0.050 0 g，置25 mL棕色容量瓶中，再分別精密加入葉黃素對(duì)照品溶液（濃度為0.716 7 mg/mL）2.0 mL，加入60 ℃水5 mL，超聲處理3 min，取出，放冷，加入0.1%BHT乙醇溶液至接近刻度，未定容，繼續(xù)超聲處理10 min，取出，放冷，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，搖勻。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，在“1.3.1”色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定樣品中葉黃素的含量，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 破囊溶劑的選擇。從表1可看出，二甲基亞砜和60 ℃水轉(zhuǎn)移率合理，破囊效果無(wú)明顯差異，考慮到二甲基亞砜刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚，水無(wú)毒、綠色環(huán)保，故選擇60 ℃水作為破囊溶劑。

2.1.2 破囊時(shí)間的選擇。從表2可看出，破囊時(shí)間為3和5 min 時(shí)，原料和樣品含量無(wú)明顯差異；破囊時(shí)間為7 min時(shí)，原料和樣品含量有所下降。從操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短方面考察，確定破囊時(shí)間為3 min。

2.1.3 提取時(shí)間的選擇。

從表3可看出，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成原料和樣品含量降低，超聲時(shí)間為10 min時(shí)，原料和樣品含量較合理。

2.1.4 提取溶劑的選擇。無(wú)水乙醇穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，葉黃素含量的RSD為4.60%，表明無(wú)水乙醇樣品溶液在24 h內(nèi)不穩(wěn)定。0.1%BHT乙醇溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，葉黃素含量的RSD為1.86%，表明0.1%BHT乙醇溶液樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察。

以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程為：Y=5.110 9X-0.063 6（R2=0.999 9）。表明葉黃素在0.139 6～2.094 0 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn)。從表5可看出，葉黃素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.76%，表明儀器精密度高。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)。從表5可看出，葉黃素含量的RSD為1.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)。從表6可看出，葉黃素的平均回收率為99.55%，RSD為2.21%，表明葉黃素的加樣回收率良好。

3 結(jié)論與討論

該研究測(cè)定葉黃素是在黨亞敏等[4]研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了N，N—二甲基甲酰胺[4]、60 ℃水[7]、二甲基亞砜[8]3種破囊溶劑，確定了破囊溶劑為60 ℃水，與其他2種破囊溶劑比較，轉(zhuǎn)移率最為合理且無(wú)毒、綠色環(huán)保；對(duì)樣品提取溶劑進(jìn)行了優(yōu)化，在無(wú)水乙醇的基礎(chǔ)上增加了0.1%BHT[8]，樣品溶液中葉黃素在24 h很穩(wěn)定，解決了葉黃素在測(cè)定過(guò)程中不穩(wěn)定的缺點(diǎn)；對(duì)破囊時(shí)間、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化和方法學(xué)考察，確定破囊時(shí)間為3 min，提取時(shí)間為10 min，此條件下葉黃素可被充分提取。綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、適用性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性佳，所用試劑綠色環(huán)保，此方法可用于保健食品中葉黃素含量測(cè)定。

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