降低軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率的研究

孫書偉 姚平 宋潔 周文杰

摘要 [目的]篩選降低軟棗獼猴桃外植體初代培養(yǎng)污染率和提升外植體誘導(dǎo)率的處理方法。[方法]采用半木質(zhì)化的軟棗獼猴桃新梢作為外植體，根據(jù)外植體滅菌時(shí)間和氨芐青霉素培養(yǎng)基濃度差異組合，分析降低軟棗獼猴桃外植體初代培養(yǎng)污染率和提升外植體誘導(dǎo)率的因素，篩選出最適宜的處理方法。[結(jié)果]增加外植體75%乙醇滅菌時(shí)間至10 s可降低軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率，培養(yǎng)基中氨芐青霉素濃度為100～150 mg/L時(shí)，軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率隨培養(yǎng)基中氨芐青霉素濃度的增加而降低。增加外植體滅菌時(shí)間和培養(yǎng)基中氨芐青霉素濃度均能增加軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)率。[結(jié)論]污染率低且誘導(dǎo)率高的處理方法為1/2MS+100 mg/L氨芐青霉素、1/2MS+150 mg/L氨芐青霉素、外植體75%乙醇滅菌10 s+0.1%升汞滅菌8 min和外植體75%乙醇滅菌10 s+0.1%升汞滅菌10 min。

關(guān)鍵詞 軟棗獼猴桃；污染率；滅菌時(shí)間；氨芐青霉素

中圖分類號(hào) S603.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）15-0087-02

Abstract [Objective] To screen the most suitable treatment for reducing Actinidia arguta primary culture contamination rate and increasing explant induction rate.[Method]Semi-woody shoots were used as explants to screen the most suitable treatment for reducing A. arguta primary culture contamination rate and increasing explant induction rate by combining sterilization time and ampicillin medium concentration. [Result]Increasing the sterilization time to 10 s could reduce the contamination rate of A. arguta primary culture， and the contamination rate of primary culture decreased with the increasing of ampicillin concentration during 100～150 mg/L. Increasing explant sterilization time and ampicillin concentration in culture medium could increase the induction rate of A. arguta.[Conclusion]1/2MS+100 mg/L ampicillin， 1/2MS+150 mg/L ampicillin， explants were sterilized with 75% alcohol with 10 s+0.1% mercuric chloride for 8 min and explants 75% alcohol sterilization 10 s+0.1% mercury chloride sterilization 10 min are the suitable methods with low contamination rate and high induction rate.

Key words Actinidia arguta Planch.；Contamination rate；Sterilization time；Ampicillin

軟棗獼猴桃屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）野生藤本果樹。軟棗獼猴桃擁有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[1]，其果實(shí)維生素含量極高，故有“VC之王”之稱。軟棗獼猴桃是雌雄異株藤本植物，常用繁殖方式有扦插、嫁接等，但繁殖速度慢，扦插繁殖成活率低，容易使植株帶菌，長(zhǎng)期進(jìn)行常規(guī)繁殖會(huì)造成品種退化[2-3]。為獲得優(yōu)良品種，對(duì)軟棗獼猴桃良種進(jìn)行離體快繁，但獲得無菌的初代苗比較困難，滅菌時(shí)間不同，其成活率不同。

20世紀(jì)70 年代至今，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究，雖然培養(yǎng)過程中獲得無菌初代培養(yǎng)苗方面有過一些報(bào)道，但結(jié)果不盡一致。潘菊等[4]先用洗衣粉水浸泡樹莓枝段10 min后，用自來水沖洗干凈；在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞溶液消毒8 min，無菌水沖洗5次獲得無菌初代苗。尤淑麗等[5]在無菌條件下，將紅樹莓莖段放入70%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞溶液消毒4 min，無菌水沖洗4～6次獲得無菌初代苗。劉長(zhǎng)春等[6]將自來水沖洗過的軟棗獼猴桃外植體，用 0.2%的洗衣粉溶液洗滌10～12 min，0.1%升汞消毒滅菌8～10 min，無菌水沖洗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此方法處理滅菌效果明顯，污染率降低，很快得到初代培養(yǎng)物。田永亮等[7]將四環(huán)素和青霉素以20 mg/L或40 mg/L的濃度加入葡萄培養(yǎng)基中，對(duì)抑制污染有一定作用，對(duì)葡萄萌芽和生長(zhǎng)無不良影響。Bistrichanov等[18]在大繡球離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，10 mg/L阿霉素可有效控制細(xì)菌污染，對(duì)培養(yǎng)物生長(zhǎng)不發(fā)生抑制作用。隨著軟棗獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，對(duì)優(yōu)良苗木的需求量也日漸增加。而軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)存在初代培養(yǎng)污染率極高的問題，大大降低了組培苗繁殖速率，因此降低軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率具有重要意義。筆者從外植體滅菌時(shí)間和抗生素培養(yǎng)基2個(gè)方面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，旨在篩選出降低軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率的有效處理方法，為工廠化育苗提供可行性理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 以遼東學(xué)院小漿果研究所軟棗獼猴桃資源圃提供的半木質(zhì)化的軟棗獼猴桃新梢作為外植體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從外植體滅菌時(shí)間和培養(yǎng)基中添加抗生素濃度2個(gè)方面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)一：取半木質(zhì)化新梢作為外植體，1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以75%乙醇滅菌8 s+0.1%升汞滅菌8 min為對(duì)照，記為CK，設(shè)置以下3種不同滅菌時(shí)間的處理：①75%乙醇滅菌8 s+0.1%升汞滅菌10 min，記為T1；②75%乙醇滅菌10 s+0.1%升汞滅菌8 min，記為T2；③75%乙醇滅菌10 s+0.1%升汞滅菌10 min，記為T3。試驗(yàn)二：取半木質(zhì)化新梢作為外植體，75%乙醇滅菌8 s+0.1%升汞滅菌8 min，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基不添加氨芐青霉素為對(duì)照，記為CK，添加50 mg/L氨芐青霉素為T4，添加100 mg/L氨芐青霉素為T5，添加150 mg/L氨芐青霉素為T6。

1.3 試驗(yàn)方法

按常規(guī)方法配制1/2MS固體培養(yǎng)基，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)每個(gè)處理40個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶20 mL培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，放入超凈工作臺(tái)中，其中120瓶冷卻至60 ℃左右，加入氨芐青霉素稀釋液，使抗生素終濃度分別為50、100、150 mg/L。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)外植體表面進(jìn)行處理消毒、接種，25 ℃，2 000 lx光照條件下培養(yǎng)，15 d后目測(cè)并統(tǒng)計(jì)外植體污染和誘導(dǎo)情況。

1.4 接種培養(yǎng)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用DPS7.55數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Duncans多重比較（P=0.05）進(jìn)行顯著性分析，Excel軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率的影響

軟棗獼猴桃外植體接種15 d后，檢測(cè)不同滅菌時(shí)間對(duì)軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率的影響。由表1可知，CK污染率最高，約為54.33%。T1處理與CK污染率無顯著差異。T2和T3處理顯著降低了軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率，與CK相比分別降低了23.30%和17.17%。即75%乙醇滅菌10 s較8 s的處理初代培養(yǎng)污染率顯著降低，而0.1%升汞滅菌8 min與10 min無顯著差異。

軟棗獼猴桃外植體接種15 d后，檢測(cè)不同濃度氨芐青霉素對(duì)軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率的影響。由表2可知，T4處理與CK污染率無顯著差異，而T5和T6處理顯著降低了軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)的污染率。即添加50 mg/L氨芐青霉素對(duì)軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率無顯著影響，添加100 mg/L和150 mg/L氨芐青霉素顯著降低了軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率，且污染率隨著氨芐青霉素濃度升高而降低。添加150 mg/L氨芐青霉素效果最佳，與CK相比初代污染率降低了34.97%。

2.2 不同處理對(duì)軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)率的影響

軟棗獼猴桃外植體接種15 d后，檢測(cè)不同滅菌時(shí)間對(duì)軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)成功率影響。由表1可知，CK成功率最低，約為30.00%。T1、T2和T3處理顯著增加了軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)成功率，與CK相比分別增加21.10%、44.43%和54.43%。即外植體進(jìn)行75%乙醇滅菌10 s的處理效果最好，而0.1%升汞滅菌8 min與10 min無顯著差異。

軟棗獼猴桃外植體接種15 d后，檢測(cè)不同濃度氨芐青霉素對(duì)軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)成功率的影響。由表2可知，T4、T5和T6處理顯著增加了軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)成功率，與CK相比分別增加了65.57%、78.90%和77.77%。即添加不同濃度氨芐青霉素顯著增加了軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)成功率，氨芐青霉素濃度在50～150 mg/L時(shí)，軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)成功率無顯著差異。

3 結(jié)論

綜上所述，增加外植體75%乙醇滅菌時(shí)間至10 s可降低軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率，培養(yǎng)基中氨芐青霉素濃度為100～150 mg/L時(shí)，軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)污染率隨培養(yǎng)基中氨芐青霉素濃度的增加而降低。6個(gè)處理均能增加軟棗獼猴桃外植體誘導(dǎo)成功率。其中污染率低且誘導(dǎo)率高的處理方法為1/2MS+100 mg/L氨芐青霉素、1/2MS+150 mg/L氨芐青霉素、外植體75%乙醇滅菌10 s+0.1%升汞滅菌8 min和外植體75%乙醇滅菌10 s+0.1%升汞滅菌10 min。

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