銀龍魚爛鰓病病原的分離和鑒定

史謝堯 賈文平 郝爽 張振國 羅璋 周文禮 馮守明

摘要 [目的]對(duì)患爛鰓病銀龍魚開展病原分離和鑒定。[方法]采用人工回歸感染試驗(yàn)確定分離菌株的致病性，利用生理生化試驗(yàn)和16S rDNA 基因序列分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]分離菌株YY-2017-3對(duì)斑馬魚具有致病性，其生理生化試驗(yàn)結(jié)果與柱狀黃桿菌相一致；YY-2017-3菌株的16S rDNA基因序列與柱狀黃桿菌聚為一支，對(duì)多種藥物顯示耐藥。[結(jié)論]菌株YY-2017-3被鑒定為柱狀黃桿菌，這是柱狀黃桿菌引起銀龍魚爛鰓病在國內(nèi)的首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞 銀龍魚；爛鰓?。徊≡?；柱狀黃桿菌

中圖分類號(hào) S941.42+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）15-0075-04

Abstract [Objective] To make the isolation and identification of pathogen from Osteoglossum bicirrhosum with gill rot disease.[Method] The pathogenicity of isolated strain was confirmed by artificial infection test，and the isolated strain was identified through physiological and biochemical tests，16S rDNA gene sequencing results.[Result] The isolated strain YY-2017-3 was pathogenic to zebra fish，and its physiological and biochemical properties were consistent with those of Flavobacterium columnare.YY-2017-3 strain formed a single cluster with 16S rDNA gene sequences of F.columnare，and it showed resistant to many kinds of antibiotics.[Conclusion]YY-2017-3 strain was identified as F.columnare.It was the first report about this bacterium caused gill roll disease of F.columnare in China.

Key words Osteoglossum bicirrhosum；Gill rot disease；Pathogen；Flavobacterium columnare

龍魚是一類古老的大型淡水魚，因其體形酷似我國神話中的龍，故俗稱龍魚，在分類上屬于輻鰭魚綱骨舌魚目骨舌魚科。龍魚是地球上比較原始的魚類，早在距今3億多年前的遠(yuǎn)古石炭紀(jì)就已經(jīng)存在，素有“活化石”之稱[1]。目前，人工養(yǎng)殖的龍魚品種主要有金龍魚、銀龍魚和紅龍魚，其中以銀龍魚養(yǎng)殖數(shù)量和市場銷量最大。銀龍魚鱗片較大，受光線照射時(shí)鱗片反射出銀白色光輝，具有較高的觀賞價(jià)值，深受觀賞魚愛好者喜愛，是一種名貴觀賞魚[2-3]。

近年來，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷發(fā)展，銀龍魚的人工培育和養(yǎng)殖技術(shù)逐步完善，廣東、河北、天津等地養(yǎng)殖企業(yè)已開展銀龍魚苗的規(guī)?；嘤⑷〉贸晒Α?017年3月中旬，天津市寧河區(qū)某銀龍魚養(yǎng)殖場發(fā)生病害，患病銀龍魚體色暗淡無光澤，厭食，聚集于水體表層，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍。筆者對(duì)患病銀龍魚進(jìn)行了病原分離與鑒定，并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，旨在為銀龍魚疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 患病銀龍魚（體長8.2～10.3 cm）來自天津市寧河區(qū)某觀賞魚養(yǎng)殖場；健康斑馬魚（體長3.2～4.1 cm）購自天津市中環(huán)觀賞魚市場。

Shieh培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[4]的方法配制；微生物生化管和藥敏片由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；LB培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術(shù)股份有限責(zé)任公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；rTaq、pMD 19T Vector，DNA Marker和Gel Extraction kit均購自TaKaRa公司。

1.2 病原的分離和寄生蟲檢查

用75%乙醇浸過的棉球?qū)疾°y龍魚進(jìn)行反復(fù)擦拭后，在無菌條件下對(duì)病魚進(jìn)行解剖，用接種環(huán)從患病魚的鰓組織取少量樣品劃線接種于Shieh平板和LB平板，另外從肝、脾、腎等組織劃線接種于LB平板和BHI平板；28 ℃培育48 h后，選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行進(jìn)一步純化，直至獲得純培養(yǎng)菌株。取患病銀龍魚的鰓絲、鰭條、體表黏液、腸道黏液、血液、肝臟、脾臟和腎臟等樣品在顯微鏡下進(jìn)行寄生蟲檢查。

1.3 病原的鑒定

1.3.1 生理生化試驗(yàn)。

將分離純化后的YY-2017-3菌株劃線接種于Shieh平板，28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察其菌落形態(tài)。生理生化試驗(yàn)按參考文獻(xiàn)[5-7]的方法進(jìn)行。生理生化試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目包括葡萄糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、鳥氨酸脫羧、精氨酸脫羧、賴氨酸脫羧、精氨酸水解、尿素、甘露醇、硫化氫、硝酸鹽還原、枸椽酸鹽、靛基質(zhì)、七葉苷、明膠、觸酶、氧化酶。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定。

參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以提取菌株YY-2017-3的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGCTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板2 μL，上下游引物各0.4 μL（濃度10 μmol/L），2 × Mix 20 μL，補(bǔ)雙蒸水至40 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接pMD-19T載體后，轉(zhuǎn)E.coil TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性比對(duì)后，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相近種的16S rDNA序列，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列匹配排列，采用鄰位相連法（Neighbor-joining） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 藥敏試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將YY-2017-3菌株接種在Shieh培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后，6 000 r/min離心集菌10 min，用無菌PBS將菌液濃度調(diào)整至1× 108 CFU/mL，取200 μL菌懸液均勻涂布于Shieh平板后，貼上藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察并記錄抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.5 人工回歸感染斑馬魚試驗(yàn) 將60尾健康斑馬魚（體長3.2～4.1 cm）隨機(jī)分成2組，分別為感染組和對(duì)照組。將水溫調(diào)節(jié)至28 ℃，24 h不間斷曝氣，暫養(yǎng)14 d后開始試驗(yàn)。感染組采用新鮮活化的YY-2017-3菌液浸泡感染，菌液終濃度為1.0 × 107 CFU/mL；浸泡1 h后，將斑馬魚撈出放回水族缸中飼養(yǎng)，對(duì)照組添加等量的Shieh培養(yǎng)基模擬浸泡感染。試驗(yàn)期間不喂食、不換水，觀察感染后斑馬魚的活動(dòng)情況，記錄死亡魚數(shù)量，及時(shí)撈走死魚。對(duì)瀕死的斑馬魚進(jìn)行解剖，取鰓部組織在Shieh平板劃線，根據(jù)科赫原則鑒定是否能再次分離到相同的細(xì)菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病魚癥狀

患病銀龍魚厭食、游泳異常、離群獨(dú)游并常浮于水體表層，呈缺氧狀態(tài)；體色暗淡、無光澤，鰓絲發(fā)白和部分腐爛。取少量鰓絲置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大量桿狀細(xì)菌呈滑行運(yùn)動(dòng)。打開腹腔后，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟異常。

2.2 病原菌的分離和形態(tài)學(xué)觀察

從患病銀龍魚的肝、脾、腎等組織中未分離到細(xì)菌，但從鰓部分離到1株細(xì)菌，暫定名為YY-2017-3。該菌株在Shieh平板上形成大小不一、邊緣不整齊、假根狀、中央較厚、干燥、淡黃色的菌落（圖1）。

2.3 病原菌的鑒定

通過革蘭氏染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)YY-2017-3菌株為革蘭氏陰性桿菌，有時(shí)彎曲成半圓形，無芽胞（圖2）。取菌懸液在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其運(yùn)動(dòng)方式為滑行。生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株YY-2017-3在尿素、硝酸鹽還原、觸酶、氧化酶、分解明膠反應(yīng)中表現(xiàn)為陽性，其他均為陰性（表1）。

以YY-2017-3菌株的總DNA為模板，對(duì)其16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 1 477 bp的核酸片段，完成測(cè)序后將序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Flavobacterium columnare strain CF2同源性最高，達(dá)99%。選用GenBank中已登錄的部分黃桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YY-2017-3菌株與柱狀黃桿菌聚成一支（圖3）。綜合生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可將YY-2017-3菌株鑒定為柱狀黃桿菌。

46卷15期 史謝堯等 銀龍魚爛鰓病病原的分離和鑒定

2.4 回歸感染試驗(yàn) 試驗(yàn)組30尾斑馬魚在感染第3天開始死亡，在感染后的7 d內(nèi)全部死亡。對(duì)照組斑馬魚沒有出現(xiàn)任何病癥。人工感染后試驗(yàn)魚表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、離群獨(dú)游、體色發(fā)黑。對(duì)瀕死魚進(jìn)行解剖檢查，發(fā)現(xiàn)斑馬魚鰓絲發(fā)白。從感染后的病魚鰓部中再次分離致病菌，進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，其結(jié)果與菌株YY-2017-3相一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)

由表2可知，在測(cè)定的16種抗生素中，菌株YY-2017-3除對(duì)氨芐青霉素和羅紅霉素敏感外，對(duì)其他抗生素均顯示出耐藥或中度敏感。

3 結(jié)論與討論

柱狀黃桿菌是較早被發(fā)現(xiàn)和研究的魚類病原之一，早在1922年Davis[10]就從患病細(xì)口鱸魚（Micropterus dolomieui）和河鱸（Perca fluviatilis）中首次分離到該菌，并將其名為柱狀芽孢桿菌（Bacillus columnaris）。1944年，該菌被Ordal等[11]從患病紅鮭魚（Oncorhynchus nerka）體內(nèi)分離，并被命名為柱形粒球黏細(xì)菌（Chondrococcus columnaris）。1945年，Garnjobst[12]從牛頭魚（Ameiurus nebulosus）體表病灶分離到該菌，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特征與柱形粒球黏細(xì)菌相似，但在產(chǎn)子實(shí)體方面存在差異，將其命名為柱狀噬纖維菌（Cytophaga columnaris）。盧全章等[13]于1975年從患爛鰓病的草魚體內(nèi)分離到柱狀黃桿菌G4株，并將其命名為魚害黏球菌（Myxococcus piscicola）。 隨著細(xì)菌分類學(xué)研究的深入，對(duì)該菌的命名幾經(jīng)更改。1996年，Bernardet等[14]利用16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合生理生化特性進(jìn)行綜合判斷，將其定名為柱狀黃桿菌。曾用名有柱狀粒球黏細(xì)菌、魚害黏球菌、柱狀噬纖維菌和柱狀屈撓桿菌（Flexibacter columnaris），都是柱狀黃桿菌的同物異名[7，14]。綜上可知，對(duì)柱狀黃桿菌的鑒定和命名，一直存在較大的爭議。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)菌分類鑒定從傳統(tǒng)的表型分類進(jìn)入基因型分類水平。一般認(rèn)為，16S rDNA同源性大于97.5%的菌株可視為同種[15]。為了對(duì)從銀龍魚體內(nèi)分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，該研究采用分子生物學(xué)鑒定和生理生化試驗(yàn)相結(jié)合的方法。結(jié)果表明，分離菌株YY-2017-3的16S rDNA基因序列與柱狀黃桿菌的同源性達(dá)到99%，并聚為一支，且生理生化特性與其他研究結(jié)果[6-7]相一致。綜合考慮，可將分離菌株YY-2017-3鑒定為柱狀黃桿菌。

柱狀黃桿菌是一種常見的水產(chǎn)動(dòng)物病原菌，其引發(fā)的柱形病又稱之為細(xì)菌性爛鰓，病給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[16-17]。柱狀黃桿菌宿主極為廣泛，草魚、鱖、鯉、鯽等淡水魚類都為易感品種，此外，也有從淡水觀賞魚中分離到該菌的報(bào)道[18]。筆者首次從銀龍魚中分離到柱狀黃桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對(duì)測(cè)定的16種藥物中只有2種顯示為敏感，這與其他研究結(jié)果[6，18]差別較大。盡管在不同的水域環(huán)境中同種細(xì)菌的藥物敏感性可能存在差異，但該研究結(jié)果表明從銀龍魚中分離的柱狀黃桿菌菌株對(duì)12種藥物顯示為耐藥，且這些藥物中部分藥物為人用藥物。由于銀龍魚價(jià)格昂貴，養(yǎng)殖戶為了提高其存活率，可能存在頻繁使用藥物或?yàn)E用藥物的情況，從而導(dǎo)致了菌株耐藥性的提高。

為了有效防治柱狀黃桿菌引發(fā)的疾病，國內(nèi)外學(xué)者開展了廣泛研究。陳昌福等[19]制備了柱狀黃桿菌注射疫苗，該疫苗表現(xiàn)出較好的免疫效果，但由于注射免疫操作煩瑣，限制了其廣泛應(yīng)用。2011年，美國農(nóng)業(yè)部研制出柱狀黃桿菌的減毒疫苗，通過浸泡免疫可獲得較好的免疫保護(hù)效果[20]，但減毒疫苗的安全性問題一直存在較大的爭議。王良發(fā)等[7]研究表明柱狀黃桿菌至少存在3種基因型，不同基因型的柱狀黃桿菌疫苗之間是否存在交叉免疫保護(hù)尚未確定。我國不同地區(qū)柱狀黃桿菌的血清型可能存在地域差異。因此，對(duì)于高檔魚類，使用本地區(qū)分離的病原菌制備成“自家疫苗”進(jìn)行注射免疫接種應(yīng)成為今后發(fā)展的趨勢(shì)。

筆者首次從銀龍魚中分離到柱狀黃桿菌，擴(kuò)大了柱狀黃桿菌的宿主范圍，也為柱狀黃桿菌的進(jìn)化分析、疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。該研究發(fā)現(xiàn)分離株YY-2017-3對(duì)多種藥物顯示耐藥，但其耐藥機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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