抑制農(nóng)業(yè)病害真菌的海洋微生物篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化

曲均革 吳慧梅 陳雄劍

摘要 [目的] 從海洋中篩選對農(nóng)業(yè)病害真菌有較強拮抗作用的海洋微生物。[方法] 以5種農(nóng)業(yè)病害真菌為篩選模型，采用平皿拮抗法對分離獲得的菌株進行初步篩選，對有活性的菌株再進行復(fù)篩，并選擇活性高的菌株進行發(fā)酵工藝優(yōu)化。[結(jié)果] 初篩中有拮抗作用的海洋細(xì)菌有21株，進行復(fù)篩后菌株MB133在稻瘟菌平板上抑菌效果最明顯，菌株MB025、MB026、MB133在油菜菌核病菌、辣椒炭疽病菌、番茄灰霉病菌平板上均存在抑菌效果。抑菌效果最明顯的菌株MB133的優(yōu)化發(fā)酵工藝：最適裝液量為12%，最適接種量為2.0%，最適培養(yǎng)基pH 7.0。[結(jié)論]該研究為農(nóng)用抗生素的推廣和應(yīng)用奠定了資源基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 海洋細(xì)菌；農(nóng)業(yè)病害真菌；篩選；農(nóng)用抗生素

中圖分類號 Q938文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號 0517-6611（2018）15-0007-03

Abstract [Objective]The aim was to screen the marine microorganisms with strong antagonism to the agricultural disease fungi.[Method] Five kinds of agricultural disease fungi were selected as screening models，and the isolated strains were screened by Petri dish antagonism.The active strains were rescreened，and the strain with highest activity was selected to optimize the fermentation process.[Result] There were 21 strains of marine bacteria that had antagonistic effects in the initial screening.The bacteriostasis effect of MB133 strain on the plate of Pyricularia oryzae was most obvious after rescreening. The bacteriostasis effects of MB025，MB026 and MB133 strains on Sclerotinia sclerotiorum，Colletotrichum capsic and Botrytis cinerea were also found.The optimum fermentation process of MB133 strain was as followed：the optimum liquid amount was 12%，and the optimum inoculation amount was 2.0%，the optimum medium was pH 7.0.[Conclusion] This research has laid the resource base for the popularization and application of agricultural antibiotics.

Key words Marine bacterium；Agricultural disease fungi；Strain screening；Agricultural antibiotics

農(nóng)業(yè)是人類的生存之本，農(nóng)藥是糧食和蔬果產(chǎn)量的重要保障。化學(xué)農(nóng)藥的使用是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)史上的一次重大變革，為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)。然而，大規(guī)模使用化學(xué)農(nóng)藥，在確保了糧食和蔬果產(chǎn)量提高的同時，也給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了巨大威脅[1-4]。微生物農(nóng)藥具有選擇性強、抗菌譜廣、活性功能多樣化及活性物質(zhì)豐富、不易出現(xiàn)抗性、不污染環(huán)境以及對動植物安全等優(yōu)點。由于海洋微生物所處的生態(tài)環(huán)境的獨特性，導(dǎo)致海洋生物體內(nèi)新陳代謝過程與陸地生物不同，可能產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、作用特殊的活性物質(zhì)。海洋微生物還具有生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域和病蟲害條件限制等多種優(yōu)良性質(zhì)[5-9]。我國既是一個農(nóng)業(yè)大國，也是一個海洋大國，從海洋微生物資源中尋找具有特殊功能的活性物質(zhì)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)是一個較新的研究方向，有著很強的創(chuàng)新性和巨大的應(yīng)用潛力[10]。隨著植物病原菌對已有農(nóng)藥的耐藥性及新病害的出現(xiàn)，要求人們不斷開發(fā)新的農(nóng)藥。尋找新的微生物源農(nóng)用活性先導(dǎo)化合物是農(nóng)藥創(chuàng)制的主要手段之一。筆者結(jié)合浙江的地域優(yōu)勢和資源特色，從浙江海域的海洋微生物中開發(fā)了具有抗農(nóng)業(yè)病害真菌特性的農(nóng)用抗生素，對推動具有浙江特色的海洋經(jīng)濟的快速發(fā)展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試海洋細(xì)菌。

待篩選的海洋細(xì)菌菌株為實驗室中從寧波洋沙山和象山海域分離純化到的菌種資源。

1.1.2 供試病原菌。

稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani，ACCC 36246）、 油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）均來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養(yǎng)基。

富集、活化、發(fā)酵培養(yǎng)采用2216E液體培養(yǎng)基，病源真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)業(yè)病害菌的接種培養(yǎng)。

取事先配制好的PDA培養(yǎng)板用于培養(yǎng)稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani，ACCC 36246）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）5種病害菌。將保藏好的5種病害菌的斜面培養(yǎng)基，利用接種鏟依次將5種病害菌接種至相應(yīng)的平板正中間，平板上做好相應(yīng)的標(biāo)記，將接種后的所有培養(yǎng)板置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.2.2 活化分離得到的海洋細(xì)菌。

取保藏的海洋細(xì)菌，接種于2216E液體培養(yǎng)基（25 mL/250 mL錐形瓶）中，于23 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。

1.2.3 離心取活化細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物。

取2 mL活化后的海洋細(xì)菌菌懸液于離心管中， 4 ℃、11 000 r/min條件下冷凍離心10 min，取上清液。

1.2.4 抗農(nóng)業(yè)病害真菌農(nóng)用抗生素活性菌株篩選。

初篩利用牛津杯法，將活化細(xì)菌的離心發(fā)酵液與5種病害菌置于PDA平板上對峙培養(yǎng)。在每塊平板下方用記號筆劃出6個相等的區(qū)域，每個區(qū)域標(biāo)上相應(yīng)的編號，每塊接種6株海洋細(xì)菌發(fā)酵液。用鑷子夾取牛津杯于酒精燈上灼燒后放于平板對應(yīng)位置，用移液槍加入200 μL菌液上清于對應(yīng)平板分區(qū)的牛津杯中，每個處理3個重復(fù)。接種后的平板繼續(xù)放在25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，選出拮抗作用較為明顯的菌株，進行復(fù)篩試驗。

1.2.5 抗農(nóng)業(yè)病害真菌農(nóng)用抗生素活性菌株的復(fù)篩。采用初篩的方法，對初篩得到的具有抑菌活性的海洋細(xì)菌進行2～3次活性菌株復(fù)篩。在重復(fù)復(fù)篩過程中，加入空白對照，對照將200 μL細(xì)菌發(fā)酵液替換為200 μL無菌2216E培養(yǎng)基，其他條件和方法同“1.2.4”，排除試驗中其他因素對試驗結(jié)果的干擾。

1.2.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化。

在250 mL三角瓶中進行液體發(fā)酵，將一定量菌液接種于2216E培養(yǎng)基中，23 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。改變某一條件，并保持其他發(fā)酵條件不變，通過測量菌株的抑菌圈，研究裝液量、接種量及pH對農(nóng)業(yè)病害真菌抑菌效果的影響。

1.2.6.1 裝液量對抑菌效果的影響。

將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于裝有25、30、35、40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，在150 r/min、pH 7.5～7.8、23 ℃條件下培養(yǎng)2 d，測定裝液量對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳裝液量。

1.2.6.2 接種量對抑菌效果的影響。

分別按2%、4%、6%、8%、10%的接種量，將菌株接種于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，在150 r/min、pH 7.5～7.8、23 ℃條件下培養(yǎng)2 d，測定接種量對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳接種量。

1.2.6.3 pH對抑菌效果的影響。

將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，分別接種于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，pH分別設(shè)5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在150 r/min、23 ℃條件下培養(yǎng)2 d，測定pH對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋細(xì)菌菌株的初篩結(jié)果

采用平皿拮抗法對99株海洋微生物菌進行農(nóng)用抗真菌活性的初篩，該方法操作簡便，能夠直接觀察到微生物之間的拮抗作用，從而篩選出活性菌株。

在初篩中觀察到21株海洋細(xì)菌可能具有抑菌作用，供試菌對稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani，ACCC 36246）、 油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）5種病害菌的試驗結(jié)果見表1。

2.2 具有抗菌活性菌株的復(fù)篩結(jié)果 采用牛津杯法將初篩得到的21株活性海洋細(xì)菌進行進一步的抗菌試驗，對活性菌株進行活性復(fù)篩，得到3株具有抑菌效果的海洋細(xì)菌，然后測定其抑菌圈直徑。

由圖1可知，菌株MB025、MB026、MB133對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）有明顯的抑菌效果，同時形成3個抑菌圈，用直尺測定直徑。由表2可知，菌株MB025、MB026、MB133對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）的抑菌圈≥17 mm。

由圖2～4可知，菌株MB025、MB026和MB133對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）都具有抑菌效果，但其抑菌效果不明顯，無法測量抑菌圈。MB133菌株對稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）抑菌效果明顯，其抑菌圈直徑為18.20 mm。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

采用牛津杯法對初篩得到的21株活性海洋細(xì)菌進行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)菌株MB133的抑菌效果最明顯，故將MB133菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

2.3.1 裝液量對菌株抑菌作用的影響。

裝液量的多少會影響發(fā)酵液中的溶氧。由圖5可知，12%的裝液量抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑為14.85 mm，以裝液量30 mL為最佳裝液量。

2.3.2 接種量對菌株抑菌作用的影響。

接種量主要影響的是發(fā)酵周期，大量地接種種子發(fā)酵液會使菌體迅速進入對數(shù)生長期，縮短了延滯期，從而縮短了發(fā)酵周期。當(dāng)接種量過大時，會使菌體提前衰退，降低細(xì)胞濃度，影響發(fā)酵水平。由圖6可知，接種量為10%時，抑菌圈直徑最大為15.85 mm，當(dāng)接種量為2%時，抑菌圈直徑為15.15 mm，以接種量2%為最佳接種量。

2.3.3 pH對菌株抑菌作用的影響。

發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對微生物的生長的影響較大，pH可能會影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成。由圖7可知，初始pH在7.0時抑菌效果最好，抑菌直徑為10.95 mm。

3 結(jié)論與討論

在初篩試驗過程中，共篩選到21株具有抑菌活性的海洋細(xì)菌。經(jīng)過復(fù)篩試驗，發(fā)現(xiàn)有3株海洋細(xì)菌具有較強抑菌活性，分別是編號為MB025、MB026、MB133的海洋細(xì)菌，它們在油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC37700）平板上具有較明顯的抑制作用，且菌株MB133對稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）的抑菌效果最明顯。這3株海洋細(xì)菌均在初篩和復(fù)篩平板上有較明顯的抑菌圈，所以確定其具有抗菌活性。另外，通過發(fā)酵條件優(yōu)化得出，菌株MB133培養(yǎng)的最適pH為7.0，接種量為2%，裝液量為12%。該研究為農(nóng)用抗生素的推廣和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)試驗將進行抑菌活性物質(zhì)的分離、提取及鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1] 邱德文.生物農(nóng)藥的發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢分析[J].中國生物防治學(xué)報，2015，31（5）：679-684.

[2] 包水明.淺論大量使用化學(xué)農(nóng)藥的負(fù)面效應(yīng)及對策[J].生物學(xué)教學(xué)，2002，27（9）：30-32.

[3] WAN M T.Ecological risk of pesticide residues in the British Columbia environment：1973-2012[J].Journal of environmental science and health part B：Pesticides，food contaminants，and agricultural wastes，2013，48（5）：344-363.

[4] HOU B，WU L H.Safety impact and farmer awareness of pesticide residues[J].Food and agricultural immunology，2010，21（3）：191-200.

[5] BERNAN V S，GREENSTEIN M，MAIESE W M.Marine microorganisms as a source of new natural products[J].Advances in applied microbiology，1997，43（4）：57-90.

[6] DONIA M，HAMANN M T.Marine natural products and their potential applications as anti-infective agents[J].The lancet infectious diseases，2003，3（6）：338-348.

[7] MAYER A M S，RODRGUEZ A D，BERLINCK R G S，et al.Marine pharmacology in 2007-8：Marine compounds with antibacterial，anticoagulant，antifungal，anti-inflammatory，antimalarial，antiprotozoal，antituberculosis，and antiviral activities； affecting the immune and nervous system，and other miscellaneous mechanisms of action[J].Comparative biochemistryand physiology part C：Toxicology & pharmacology，2011，153（2）：191-222.

[8] WATERS A L，HILL R T，PLACE A R，et al.The expanding role of marine microbes in pharmaceutical development[J].Current opinion in biotechnology，2010，21（6）：780-786.

[9] 田黎，陳杰，何運轉(zhuǎn)，等.農(nóng)用抗生素的新資源——海洋微生物[J].中國生物防治，2003，19（3）：121-124.

[10] 曲均革，姚曉敏，朱鵬，等.產(chǎn)纖維素酶海洋細(xì)菌的篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2012，21（6）：1053-1057.