烤煙存儲(chǔ)期間煙葉酶活性變化的初步研究

王川 劉紫薇 朱啟法 張麗娜 馬稱心 張朝 高琴 陳學(xué)平

摘要 [目的]探究初烤煙存儲(chǔ)過(guò)程中煙葉相關(guān)酶活性變化。[方法]以烤煙品種 NC89 為材料，研究皖南地區(qū)煙葉存儲(chǔ)過(guò)程中多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性隨存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)。[結(jié)果]隨著存儲(chǔ)時(shí)間變長(zhǎng)，幾種酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中多酚氧化酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶活性在存儲(chǔ)180 d時(shí)分別達(dá)到最大值[50.50 U/g，34.20、0.54△OD/（g·min）]，而過(guò)氧化物酶活性則在存儲(chǔ)270 d時(shí)達(dá)到最大值（118.90 U/g）。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步豐富煙葉陳化理論，探究烤煙存儲(chǔ)質(zhì)量提升形成機(jī)理提供了參考。

關(guān)鍵詞 烤煙；存儲(chǔ)；酶活性

中圖分類號(hào) TS41+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）15-0001-02

Abstract [Objective]To explore the activity changes of related enzymes in flue-cured tobacco leaves during storage. [Method]We studied the activity change trends of polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， lipoxygenase （LOX） and phenylalanine lyase （PAL） in tobacco leases with the extension of storage time based on NC89 flue-cured tobacco as experimental material in south Anhui. [Result]As the storage time increased， the activity of four enzymes showed a tendency of increasing first and then decreasing. The maximum activity of polyphenol oxidase， lipoxygenase and phenylalanine were reached when the tobacco were stored 180 days. The maximum were 50.50 U/g， 34.20， 0.54 △OD/（g·min）， respectively， while the peroxidase activity reached the maximum（118.90 U/g） when the tobacco were stored 270 days.[Conclusion]The study provides a reference for further enriching the theory of tobacco leaf aging and exploring the mechanism of improving the quality of flue-cured tobacco during storage.

Key words Flue-cured tobacco；Storage；Enzyme activity

煙葉陳化能夠改善煙葉的香味品質(zhì)，是提高煙葉可用性的重要環(huán)節(jié)[1]。在煙葉存儲(chǔ)期間，煙葉內(nèi)各種化學(xué)變化借助自然氣候的變化加速進(jìn)行，從而改善煙葉品質(zhì)和理化性狀，這一過(guò)程被稱為自然陳化。酶類是陳化過(guò)程中提高煙葉發(fā)酵質(zhì)量的動(dòng)力，是煙葉陳化的主要機(jī)理之一[2]?？緹煷鎯?chǔ)過(guò)程中，在酶類的作用下烤煙煙葉中的多種物質(zhì)氧化分解形成重要的香氣成分，多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶則是其中主要的酶類，對(duì)促進(jìn)煙葉陳化發(fā)酵、提高煙葉品質(zhì)具有積極作用。前人[3-6]對(duì)初烤煙存儲(chǔ)期間相關(guān)酶的活性變化進(jìn)行了大量的研究。為了進(jìn)一步豐富煙葉陳化理論、探究烤煙存儲(chǔ)質(zhì)量提升形成機(jī)理，筆者以皖南地區(qū)存儲(chǔ)烤煙為材料，研究了烤煙在陳化過(guò)程中多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、脂氧合酶、苯丙氨酸裂解酶活性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

以烤煙品種NC89初烤煙為材料，烘烤后于自然條件下儲(chǔ)存。每隔45 d取1次樣，煙葉去主脈，干燥、粉碎后備用。

1.2 方法

1.2.1 多酚氧化酶活性測(cè)定。參照朱廣廉等[7]的方法：取1 g樣品，加入預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）1 mL，研磨，再加1 mL緩沖液，傾入5 mL離心管，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液。反應(yīng)體系為3 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚（用pH 7.8磷酸緩沖液配制），1 mL酶液，以滅活酶液作為空白對(duì)照，于30 ℃下水浴10 min，立即用20%三氯乙酸中止反應(yīng)。5 000 r/min離心10 min后，取上清液于495 nm處測(cè)定其吸光值。

1.2.2 過(guò)氧化物酶活性測(cè)定。參照李玲等[8]的方法：取1 g樣品，加入0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），在冰浴中研磨，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。4.7 mL反應(yīng)液包括2.7 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 5.5），1.0 mL 2%的H2O2，1.0 mL 0.05 mmol/L愈創(chuàng)木酚。向反應(yīng)液中加入0.3 mL 酶液（空白管為0.3 mL pH 7.0的磷酸緩沖液）混勻后，水浴 37 ℃反應(yīng)15 min，冷卻后測(cè)定其在470 nm處的吸光值。

1.2.3 脂氧合酶活性測(cè)定。參照宮長(zhǎng)榮等[9]的方法：取0.5 g樣品，加入0.10 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）在冰浴中研磨，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。取0.3 mL酶液于試管中，加入2 mL底物乳狀液（2.24 mmol/L亞油酸分散于含0.5 μL/mL吐溫-20的0.1 mol/L、pH 9.0的硼酸緩沖液中），混勻后放入30 ℃水浴中并開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)3 min后加入5 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，然后加入5 mL蒸餾水混勻并測(cè)定其在234 nm處的吸光值。

1.2.4 苯丙氨酸裂解酶測(cè)定。參考張志良等[10]的方法：取1 g樣品，加入0.10 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）在冰浴中研磨，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。1 mL酶液中加1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，2 mL蒸餾水，總體積為4 mL。空白管不加底物，多加1 mL蒸餾水。反應(yīng)液于30 ℃水浴中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后于290 nm處測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 存儲(chǔ)期間多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性分析

由圖1可知，存儲(chǔ)初期多酚氧化酶活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，存儲(chǔ)0～90 d時(shí)上升較緩，90～180 d過(guò)程中酶活性迅速升高，在180 d時(shí)酶活性達(dá)到最大值 （50.50 U/g），此時(shí)是存儲(chǔ)初期多酚氧化酶活性的5.55倍；之后隨存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)酶活性迅速降低，至270 d時(shí)趨于平穩(wěn)；存儲(chǔ)360 d時(shí)，煙葉中多酚氧化酶活性降低到5.48 U/g。

由圖2可知，烤煙煙葉過(guò)氧化物酶活性在存儲(chǔ)初期迅速上升，至180 d后上升趨勢(shì)變緩，存儲(chǔ)270 d時(shí)過(guò)氧化物酶活性達(dá)到最大值（118.90 U/g），此時(shí)是存儲(chǔ)初期酶活性的17.49倍；之后隨存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)酶活性迅速下降，至存儲(chǔ)360 d時(shí)酶活性降低到34.50 U/g，此時(shí)過(guò)氧化物酶活性仍顯著高于存儲(chǔ)初期，是存儲(chǔ)初期過(guò)氧化物酶活性的5.07倍。

2.2 存儲(chǔ)期間脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶活性分析

由圖3可知，在烤煙存儲(chǔ)過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，烤煙煙葉中脂氧合酶活性變化與多酚氧化酶呈現(xiàn)的先升高后降低的變化趨勢(shì)基本一致。存儲(chǔ)初期脂氧合酶活性不斷升高，到180 d時(shí)達(dá)最高值[34.20△OD/（g·min）]，較存儲(chǔ)初期脂氧合酶活性增加了72.55%。而后脂氧合酶活性逐漸下降，存儲(chǔ)180～225 d酶活性下降較快，之后下降變緩；存儲(chǔ)360 d時(shí)脂氧合酶活性為24.10△OD/（g·min）。

由圖4可知，存儲(chǔ)初期苯丙氨酸裂解酶活性為0.31△OD/（g·min），之后隨存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)酶活性持續(xù)升高，至存儲(chǔ)180 d時(shí)達(dá)最大值[0.54△OD/（g·min）]，酶活性較存儲(chǔ)初期增加了74.19%。之后隨時(shí)間延長(zhǎng)酶活性緩慢下降，至存儲(chǔ)315 d后趨于平穩(wěn)。存儲(chǔ)360 d時(shí)，苯丙氨酸裂解酶達(dá)0.44△OD/（g·min），仍顯著高于存儲(chǔ)初期。

3 結(jié)論與討論

對(duì)皖南地區(qū)烤煙煙葉中酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，在存儲(chǔ)期間，煙葉中的多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、脂氧合酶及苯丙氨酸裂解酶一直具有一定活性，并且具有相似的變化規(guī)律：存儲(chǔ)初期，4種酶活性均隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上升，至存儲(chǔ)180 d或270 d后達(dá)到最大值，隨后酶活性逐漸下降。這與趙銘欽等[11-12]、韓錦峰等[13]的研究結(jié)果一致。

在多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的共同作用下，烤煙煙葉中的多酚類物質(zhì)可被氧化成為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)又與氨基酸、蛋白質(zhì)及其他化合物縮合成大分子物質(zhì)，形成香氣物質(zhì)的前體物，并賦予煙草制品優(yōu)雅的香氣、改善余味、增加香氣量，對(duì)提高烤煙煙葉的品質(zhì)具有良好作用[14-15]。脂氧合酶是脂類物質(zhì)氧化降解代謝過(guò)程中的重要酶。類胡蘿卜素在脂氧合酶的作用下可以氧化分解成中間產(chǎn)物香葉醇、紫羅蘭酮、紫黃質(zhì)、黃質(zhì)醛等，是烤煙煙葉中的重要致香物質(zhì)[16]。苯丙氨酸裂解酶主要參與煙葉中苯丙氨酸的代謝，烤煙煙葉中許多重要揮發(fā)性香氣成分如苯甲醇、苯乙醇等的形成均與其代謝密切相關(guān)[17]?？緹煙熑~中多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶的酶活性在存儲(chǔ)期間的動(dòng)態(tài)變化很可能與煙葉表面微生物的活性變化有關(guān)。煙葉陳化過(guò)程是一個(gè)經(jīng)過(guò)烘烤之后不存在生命活性的干物體自然發(fā)酵過(guò)程。煙葉自身存在的酶在初烤階段幾乎全部高溫鈍化失活，煙葉自身的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也遭到破壞。而隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性逐漸增加則可能與烤煙煙葉表面的微生物活動(dòng)有關(guān)?？緹煙熑~表面微生物分泌酶從而導(dǎo)致烤煙煙葉的酶活性發(fā)生變化，因此煙葉表面的微生物分泌物可能加速烤煙陳化，促進(jìn)陳化的進(jìn)行從而改善烤煙煙葉的內(nèi)在質(zhì)量。利用微生物進(jìn)行烤煙的人工陳化可以提高陳化效率，對(duì)存儲(chǔ)期間烤煙品質(zhì)的改善具有積極作用，并有待于進(jìn)一步的深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 于建軍.卷煙工藝學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[2] 宮長(zhǎng)榮，劉霞，郭瑞，等.淀粉代謝及影響烤煙淀粉含量的因素[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（6）：745-748.

[3] 張西仲，徐曉燕，韓忠明，等.烤煙片煙陳化過(guò)程中化學(xué)成分及相關(guān)酶活性的分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（6）：24-26.

[4] 錢(qián)衛(wèi)，田敏，李麗莉，等.烤煙葉面微生物 5 種水解酶的產(chǎn)生，溫度穩(wěn)定性及其在煙葉人工陳化中的應(yīng)用[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2006，41（5）：155-160.

[5] 趙銘欽，王豹祥，邱立友，等.不同陳化時(shí)期的煙葉酶活性變化及其同工酶酶譜分析[J].煙草科技，2006（3）：52-54.

[6] RUAN A D，MIN H.Studies on microbiological degradation of tobacco tar[J].Journal of environmental science and health，2005，40（11）：2073-2083.

[7] 朱廣廉，張愛(ài)琴.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：北京大學(xué)出版社，1990.

[8] 李玲.植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[9] 宮長(zhǎng)榮，李艷梅，楊立均.水分脅迫下離體煙葉中脂氧合酶活性、水楊酸與茉莉酸積累的關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（3）：269-272.

[10] 張志良，吳光耀.植物生物化學(xué)技術(shù)和方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版杜，1986.

[11] 趙銘欽，邱立友，張維群，等.陳化期間烤煙葉片中生物活性變化的研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19（6）：537-542.

[12] 趙銘欽，王豹祥，邱立友，等.不同陳化時(shí)期烤煙葉片中酶活性及其相關(guān)化學(xué)成分分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，11（4）：7-10.

[13] 韓錦峰，朱大恒，楊素勤，等.不同陳化時(shí)期烤煙幾種酶活性及其相關(guān)化學(xué)成分的分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，1999（1）：1-2.

[14] 王瑞新.煙草化學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[15] 李叢民.植物多酚對(duì)煙草制品品質(zhì)的影響[J].煙草科技，2000（1）：27-28.

[16] 張榮平.脂氧合酶在植物體內(nèi)的生理功能[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，10（1）：47-51.

[17] 朱大恒，陳銳，陳再根，等.烤煙自然醇化與人工發(fā)酵過(guò)程中微生物變化及其與酶活性關(guān)系的研究[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2001，7（2）：26-30.