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    斯魯菲亞海洋紅酵母培養(yǎng)基優(yōu)化

    2018-05-14 08:59:52張川徐志進(jìn)柳敏海
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年28期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵

    張川 徐志進(jìn) 柳敏海

    摘要[目的]比較不同的碳源、氮源、無機(jī)鹽對斯魯菲亞海洋紅酵母(Rhodotorula slooffiae)菌株產(chǎn)量的影響,確定培養(yǎng)基最優(yōu)組分。[方法]通過葡萄糖、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀4因素3水平的正交試驗(yàn),確定斯魯菲亞海洋紅酵母的最優(yōu)培養(yǎng)基。[結(jié)果]斯魯菲亞海洋紅酵母的最優(yōu)培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:葡萄糖2%,酵母浸粉0.75%,硫酸銨0.5%,磷酸二氫鉀1%。接種量6%,500 mL三角錐形瓶,裝液量100 mL,培養(yǎng)溫度30 ℃,經(jīng)過48 h培養(yǎng),菌種量最大可達(dá)8.6×108 CFU/mL,比優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量(6.6×108 CFU/mL)提升了30%。[結(jié)論]培養(yǎng)條件和工藝的優(yōu)化可以顯著提高海洋紅酵母菌量和類胡蘿卜素含量。

    關(guān)鍵詞海洋紅酵母;發(fā)酵;培養(yǎng)條件優(yōu)化

    中圖分類號S917.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611(2018)28-0001-03

    Fermentation Conditions Optimization of Rhodotorula slooffiae

    ZHANG Chuan,XU Zhijin,LIU Minhai et al

    (Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan,Zhejiang 316000)

    Abstract[Objective]The effects of different carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts on fermentation yield of marine red yeast(Rhodotorula slooffiae) were compared to determine the optimal medium components. [Method]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined by 4 factors and 3 levels orthogonal test.[Result]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined: glucose 2%, yeast extract powder 0.75%, ammonium sulfate 0.5%, monopotassium phosphate 1%, and inoculation amount 6%, temperature 30 ℃, 100 mL medium in 500 mL triangle bottle and fermentation time 48 h. Under above conditions, the cell biomass of marine red yeast can reach 8.6×108 cfu/mL, which increased by 30% as compared with the fermentation before optimization. [Conclusion]Optimization of culture conditions and process can significantly increase the amount of marine red yeast and carotenoid content.

    Key wordsMarine red yeast;Fermentation;Conditions optimization

    海洋紅酵母(Rhodotorula slooffiae)是存在于海水中的一種單細(xì)胞酵母品系,大部分分布在海水和海底沉積物中,通過合成各種酶和代謝產(chǎn)物,可以在極端環(huán)境下生存;也有一些種類寄附在魚蝦和貝類上,互利共生[1-2]。海洋紅酵母富含豐富的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、天然色素、維生素等生物活性物質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價值,此外還可以使水產(chǎn)動物色澤亮麗,肉質(zhì)鮮美,常被作為水產(chǎn)動物育苗的開口餌料[3-4]。海洋紅酵母中含有的葡聚糖和甘露糖蛋白等成分,使其能刺激宿主的免疫和抗氧化系統(tǒng),提高抗氧化、生物免疫力和抗基因毒性等功能[5]。養(yǎng)殖飼料中添加海洋紅酵母可以有效提高水產(chǎn)動物幼苗的存活率和抗病能力,還可以提高蝦青素在動物體內(nèi)的積累,增強(qiáng)動物免疫力和惡劣環(huán)境耐受力[6]。

    在生態(tài)環(huán)境修復(fù)方面,海洋紅酵母可以將烴類化合物降解為小分子物質(zhì),吸收重金屬離子,處理海洋污染。水體酸化方面應(yīng)用廣泛。海洋紅酵母能夠促進(jìn)腸道中益生菌的生長繁殖,起到調(diào)整腸胃的發(fā)酵過程以及pH,有助于腸胃平時的消化吸收活動,其作為食品添加劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品加工中[7]。

    近年來,關(guān)于海洋紅酵母的研究逐漸增加,主要集中在菌種的選育、代謝產(chǎn)物的測定、發(fā)酵工藝優(yōu)化和促進(jìn)類胡蘿卜素合成等方面。優(yōu)化海洋紅酵母的發(fā)酵工藝具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟(jì)價值。該研究從選擇最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽及最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)入手,優(yōu)化斯魯菲亞海洋紅酵母培養(yǎng)基,提高產(chǎn)率降低成本,旨在為該菌株的下一步工業(yè)化發(fā)酵罐生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

    1材料與方法

    1.1菌種

    1.1.1菌種來源。

    海洋紅酵母,由遼東學(xué)院提供,菌株培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基。

    1.1.2培養(yǎng)基。

    YPD培養(yǎng)基:葡萄糖2.0%,蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,瓊脂2.0%,陳海水100 mL,自然pH。種子培養(yǎng)基:葡萄糖1.0%,硫酸銨1.0%,酵母浸粉1%,磷酸二氫鉀1%,陳海水100 mL,自然pH。

    1.1.3菌株培養(yǎng) 。

    斜面活化。保存于冰箱中的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上活化,30 ℃培養(yǎng)48 h。

    1.1.4搖床擴(kuò)陪。從斜面培養(yǎng)基上接種到500 mL三角錐形瓶中,裝液量為80 mL,30 ℃,160 r/min,培養(yǎng)24 h形成種子培養(yǎng)基。再將種子培養(yǎng)基以6%的接種量,接入裝量100 mL的500 mL 錐形瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為180 r/min。

    1.1.5酵母菌的生理生化鑒定。

    參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》[8]和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9]對海洋紅酵母進(jìn)行糖源發(fā)酵、碳源同化、氮源同化等生理生化試驗(yàn)。

    1.2培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)

    1.2.1單因素試驗(yàn)。

    以種子培養(yǎng)基為基準(zhǔn)培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基要素,其中,

    碳源試驗(yàn):以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉為碳源,含量為同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%~2%),培養(yǎng)條件:溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2;培養(yǎng)容器為三角錐形瓶;培養(yǎng)時間為48 h。

    氮源試驗(yàn):分別以硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母浸粉為氮源,含量設(shè)置為同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%;培養(yǎng)條件:溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2;培養(yǎng)容器:三角錐形瓶;培養(yǎng)時間4 8 h。

    無機(jī)鹽試驗(yàn):以磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣為其他無機(jī)成分,含量為同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%~2%),培養(yǎng)條件:溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2;培養(yǎng)容器:三角錐形瓶;培養(yǎng)時間48 h。

    以海洋紅酵母生物量為參考指標(biāo),挑選適宜的碳源、氮源和無機(jī)鹽以及培養(yǎng)基用量。

    1.2.2正交試驗(yàn)。

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇葡萄糖、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀4個因素,各取3個水平(表1),共設(shè)有9個組,每組有3個平行對照,取各數(shù)據(jù)平均值,篩選出最優(yōu)組合。

    1.3細(xì)胞生物量測定

    采用血球板計數(shù)法,將取出的發(fā)酵液稀釋100倍,用膠頭滴管吸取后滴到血球計數(shù)板上,用蓋玻片蓋好,放于顯微鏡40倍鏡下觀察并找到網(wǎng)格,換100倍鏡計數(shù)[8]。

    1.4類胡蘿卜素提取與測定

    采用丙酮法萃取得到類胡蘿卜素提取液,使用分光光度計在475 nm處測定吸光度,根據(jù)公式計算:色素含量(μg/g干菌體)=Amax×D×V/0.16W,式中,A為475 nm波長處的吸光度,V為丙酮的用量(mL),D為測定試樣時的稀釋倍數(shù),W為酵母菌干重(g),0.16為胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)[10]。

    2結(jié)果與分析

    2.1酵母菌生長曲線

    發(fā)酵培養(yǎng)后,從0 h開始,每隔6 h取樣一次,進(jìn)行菌數(shù)測定,記錄數(shù)據(jù),并繪制該菌株生長曲線,如圖1所示。從圖1可以看出,在接種6 h之后,菌體即快速生長,6~36 h菌株進(jìn)入對數(shù)期快速增長,菌的數(shù)量達(dá)到最高6.6×108 CFU/mL,36 h后菌數(shù)下降,之后逐漸進(jìn)入衰亡期。

    2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1最佳碳源和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    用4種不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉)作比較試驗(yàn),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同(1%),在其他成分相同的情況下,斯魯菲亞紅酵母對4種碳源都能夠同化,其中對葡萄糖利用效果最好(表2)。以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中,酵母菌的生物量達(dá)到5.6×108 CFU/mL;而使用淀粉作為碳源效果最差,酶母菌的生物量只有3.7×108 CFU/mL。麥芽糖在提高菌體中類胡蘿卜素含量方面效果最好,葡萄糖次之,蔗糖最差。

    以葡萄糖作為碳源,選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果如圖2所示。在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%~2%時,隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,菌量也在增大,當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到2%時菌數(shù)最高;當(dāng)葡萄糖濃度大于2%時,菌數(shù)逐漸下降,當(dāng)葡萄糖濃度為5%時,菌數(shù)最低只有4.8×108 CFU/mL。綜上所述,選擇2%葡萄糖作為碳源,海洋紅酵母的產(chǎn)量最高,達(dá)到6.2×108 CFU/mL,葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高過低都不利于紅酵母增殖。

    2.2.2最佳氮源的確定。

    用4種不同的氮源(蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、酵母浸粉)作比較試驗(yàn),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同(1%),在其他成分相同的情況下,發(fā)現(xiàn)含有酵母浸粉的培養(yǎng)基對菌體生長更有利,菌數(shù)最高可達(dá)5.57×108 CFU/mL(表3)。有機(jī)氮源對菌生物量的促進(jìn)作用高于硫酸銨、氯化銨這些無機(jī)氮源;但無機(jī)氮源更有益于類胡蘿卜素含量的增加[11]。通過無機(jī)氮源和有機(jī)氮源的科學(xué)調(diào)配可以實(shí)現(xiàn)對海洋紅酵母發(fā)酵后期效價單位的漲幅調(diào)控和生長周期的延長,所以應(yīng)該在培養(yǎng)基中選擇一定量的硫酸銨搭配酵母浸粉使用[12]。

    2.2.3最佳無機(jī)鹽的確定。

    用3種無機(jī)鹽(磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂)作比較試驗(yàn),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同(1%),在其他成分相同的情況下,發(fā)現(xiàn)含有磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基對菌體生長和類胡蘿卜素的合成促進(jìn)作用更明顯(表4)。

    以磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽,檢驗(yàn)不同濃度下磷酸二氫鉀對海洋紅酵母生物量的影響,結(jié)果如圖3所示。當(dāng)無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%~1.0%,酵母菌生物量隨著鹽濃度升高而增加。無機(jī)鹽濃度在1.0%~2.0%時,鹽濃度抑制酵母菌量的增長,在2.0%~2.5%時生物量又略有上升??傮w來說,培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時,菌數(shù)最大為4.72×108 CFU/mL。

    2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

    通過單因素試驗(yàn),確定培養(yǎng)基最優(yōu)組分。使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性差異分析。從表5可知,4種因素對斯魯菲亞海洋紅酵母菌株發(fā)酵菌量影響各不相同,順序?yàn)锽>A>D>C。硫酸銨濃度變化對海洋紅酵母菌數(shù)影響不顯著(P>0.05),酵母浸粉濃度的變化對海洋紅酵母菌數(shù)具有顯著性影響(P<0.05),其最適濃度為0.75%。海洋紅酵母菌數(shù)最優(yōu)培養(yǎng)條件為A2B3C1D2,即葡萄糖2%,酵母浸粉0.75%,硫酸銨0.5%,磷酸二氫鉀1.0%,在此優(yōu)化條件下海洋紅酵母菌量可達(dá)8.6×108 CFU/mL,比優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基(6.6×108 CFU/mL)提升了30%。

    3結(jié)論與討論

    對斯魯菲亞海洋紅酵母進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化,對于提高菌的生物量而言葡萄糖效果最好,最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%;最佳氮源為酵母粉和硫酸銨,最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.75%和0.5%;無機(jī)鹽中1.0%磷酸二氫鉀效果最好。在此培養(yǎng)條件下,海洋紅酵母菌量最大可達(dá)到8.6×108 CFU/mL,比優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基(6.6×108 CFU/mL)提升了30%。正交試驗(yàn)中4種因素對斯魯菲亞海洋紅酵母菌株發(fā)酵菌量影響各不相同,其中酵母浸粉>葡萄糖>磷酸二氫鉀>硫酸銨。需要指出的是配比3%葡萄糖、0.75%酵母浸粉、1%硫酸銨、1%磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基,紅酵母菌量達(dá)到8.4×108 CFU/mL,實(shí)際生產(chǎn)過程中可以根據(jù)原料來源和成本綜合考量,選擇最優(yōu)配比。

    海洋紅酵母是海洋環(huán)境中重要的菌種資源,其所含有的豐富營養(yǎng)物質(zhì)及代謝過程中產(chǎn)生的活性物質(zhì),使其具有廣泛的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益。現(xiàn)階段國內(nèi)外學(xué)者對海洋紅酵母的研究大多集中在菌種選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化和促進(jìn)類胡蘿卜素合成等方面的研究。而培養(yǎng)基中不同的pH、溫度、光照和接種量也會影響紅酵母的生物量和類胡蘿卜素的產(chǎn)量[13-14],添加不同金屬離子和氨基酸對海洋紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素具有重要的影響[3]。綜上研究可見,不同的培養(yǎng)條件和工藝對海洋紅酵母的生長和色素的合成有很大的影響,所以進(jìn)一步研究優(yōu)化海洋紅酵母的培養(yǎng)條件,能為海洋紅酵母的開發(fā)應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐意義[15]。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 趙述淼,韓繼宏.淺談酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用[J].中國水產(chǎn),2003(7):68-69.

    [2] 李臣,阮榕生,林向陽,等.紅酵母的性質(zhì)及其應(yīng)用研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2006(5):20-22,25.

    [3] 劉秀蓮,王宇光.海洋紅酵母的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2008,19(2):293-295.

    [4] 趙昌會,羅靜瑤.海洋酵母菌的研究進(jìn)展[J].湖南科技學(xué)院學(xué)報,2008,29(8):59-60.

    [5] 張超,劉軍.SCP生產(chǎn)菌海洋紅酵母搖瓶培養(yǎng)研究[J].四川輕化工學(xué)院學(xué)報,2010,13(3):71-74.

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