煙草根系分泌物成分的鑒定及其對(duì)煙草疫霉菌的影響

馮超 戰(zhàn)徊旭 崔萌萌 徐傳濤 王曉強(qiáng) 陳德鑫

摘要 [目的]探究煙草根系分泌物不同成分對(duì)煙草疫霉菌的影響。[方法]利用液質(zhì)聯(lián)用法鑒定煙草革新3號(hào)根系分泌物的成分，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定煙草根系分泌物的抑菌效應(yīng)。[結(jié)果]相對(duì)含量較高的32種煙草根系分泌物中，有12種分泌物對(duì)煙草疫霉菌具有抑制作用，5種具有促生作用；在800 μg/mL濃度處理下，酒石酸、水楊酸、2-呋喃甲酸和土木香內(nèi)酯對(duì)煙草疫霉菌抑制率分別為92.87%、97.14%、91.33%和93.76%，以水楊酸的抑菌效果最佳，與對(duì)照相比，其EC50均小于500 μg/mL，其中酒石酸的毒力最強(qiáng)，EC50為159.68 μg/mL。[結(jié)論]酒石酸、水楊酸、2-呋喃甲酸和土木香內(nèi)酯4種根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌有較好的生防效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 煙草；根系分泌物；煙草疫霉菌；生物活性；抑制作用

中圖分類號(hào) S435.72；TS411+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0148-05

Abstract [Objective] The aim was to determine the effect of tobacco root exudates on Phytophthora nicotianae.[Method]LCMS，determination of inhibitory effects were used to reveal the inhibiting effects of tobacco Gexin 3 root exudates on Phytophthora nicotianae.[Result]There were 32 compounds with high contents in tobacco root exudates.Among them，12 compounds had the effect on inhibiting；5 compounds had the effect on promoting P.nicotianae；the others had no inhibiting effect.Compared with the control，tartaric acid，salicylic acid，2furoic acid and alantolactone had significant inhibition on the growth of mycelium of P.nicotianae，and their inhibition rates at 800 μg/mL were 92.87%，97.14%，91.33% and 93.76%，respectively.Salicylic acid had the strongest inhibition effect.The EC50 of them were less than 500 μg/mL.Tartaric acid had the strongest toxicity，and its EC50 was 159.68 μg/mL.[Conclusion]Four root exudates can effectively control P.nicotianae.

Key words Tobacco；Root exudates；Phytophthora nicotianae；Biological activity；Inhibition effect

煙草黑脛病是由煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）侵染引起的一種毀滅性土傳病害，黑脛病菌的游動(dòng)孢子形成快且數(shù)量大，侵染煙株后潛育期短、發(fā)病快，在一個(gè)季節(jié)可以發(fā)生多次侵染[1]。在我國(guó)，煙草黑脛病菌有0號(hào)和1號(hào)2個(gè)生理小種，以0號(hào)小種為優(yōu)勢(shì)小種[2]。近年來(lái)煙草黑脛病在我國(guó)發(fā)生普遍，嚴(yán)重?zé)熖锇l(fā)病率在45%以上，甚至造成煙田絕收，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。目前，煙草黑脛病的防治措施仍以藥劑防治為主，化學(xué)藥劑容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境污染、殘留等問(wèn)題。因此，在烤煙生產(chǎn)中需要尋求一種天然、環(huán)保、有效的途徑來(lái)控制煙草黑脛病的發(fā)生[6-8]。

根系分泌物是在植物生長(zhǎng)過(guò)程中根系向環(huán)境中釋放的一系列物質(zhì)，如有機(jī)酸、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、黏膠質(zhì)、細(xì)胞脫落物等[9-10]。根系分泌物影響和調(diào)節(jié)著根際土壤的物理特性、營(yíng)養(yǎng)有效性以及植物根系與根際土壤微生物、病原菌及其他生物之間化學(xué)信號(hào)交流的生物學(xué)過(guò)程。對(duì)于植物緩解外界脅迫、促進(jìn)養(yǎng)分及與土壤的物質(zhì)交流等具有重要作用[11]。

煙草革新3號(hào)作為選育抗煙草黑脛病高抗品種[12]，在與土壤交流的生物學(xué)過(guò)程中，向土壤釋放不同種類的根系分泌物，研究這些物質(zhì)潛在的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)防治煙草疫霉菌有重要的理論指導(dǎo)意義。鑒于此，筆者篩選了革新3號(hào)根系分泌物主成分，并研究了根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌的抑制效應(yīng)，旨在篩選出高效、安全的防治材料，為安全有效防治煙草黑脛病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草。革新3號(hào)（高抗煙草疫霉菌品種）和小黃金1025（高感煙草疫霉菌品種）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草種質(zhì)資源庫(kù)提供。

1.1.2 供試菌株。煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）0號(hào)生理小種由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究室分離、純化。

1.1.3 供試藥劑。蓖麻烯、棕櫚酸、l-2-氨基-3-甲基正丁酸、丁酰乳酸乙酯購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司；纈草酸、對(duì)庚氧基苯甲酸、油酸、硬脂酸、三丁酸甘油酯、土木香內(nèi)酯購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；酒石酸、γ-亞麻酸購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氧化聚乙烯、洛柯寧堿、茉莉酮購(gòu)自北京普益華科技有限公司；環(huán)己胺、二硝托胺、2，4-戊二烯-4-內(nèi)酯購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；硫代苯甲酸S-羥甲酯、水楊酸、亞麻酸、2-呋喃甲酸、肉桂酸異戊酯三丙酸甘油酯、海墨菊內(nèi)酯、松香醇購(gòu)自北京中冉旭升科技發(fā)展有限公司；6-姜酚、2-乙?；量?、甲基黃嘌呤、癸烯二酸、6，7-二羥基香豆素、多巴醌購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 主要儀器。儀器分析平臺(tái)為L(zhǎng)C-Q/TOF-MS： Ultimate 3000 高效液相（美國(guó)Thermo公司），Orbitrap Elite質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司），分離色譜柱C18色譜柱[Hypergod C18 （100.0 mm×4.6 mm×3 μm），美國(guó)Thermo公司]；真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；Milli-Q（18.2i）超純水處理系統(tǒng)（美國(guó) Millipore 公司）；電子天平。

1.2 方法

1.2.1 根系分泌物的收集。

參照張文明等[13]的方法收集根系分泌物。將4葉期煙苗定植于花盆中后，置于人工氣候室連續(xù)培養(yǎng)56 d，培養(yǎng)晝夜溫度為白天30 ℃、夜晚25 ℃。培養(yǎng)基質(zhì)為滅菌土壤、草炭和珍珠巖（體積比為2∶2∶1）。取出煙株，將根部泥土清洗干凈，置于無(wú)菌水中靜置24 h，取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)。濾液冷凍干燥后-20 ℃保存。

1.2.2 根系分泌物的LC-MS檢測(cè)。

1.2.2.1 色譜條件。柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相組成A為水+0.1%甲酸，B為乙腈+0.1%甲酸。進(jìn)樣量為4 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI源），同時(shí)采用正、負(fù)2種離子化模式檢測(cè)。正模式：離子源溫度300 ℃，鞘氣45 arb，輔助氣15 arb，吹掃氣1 arb，噴霧電壓為3.0 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，碰撞誘導(dǎo)解離能量為30%；負(fù)模式：離子源溫度為300 ℃，鞘氣為45 arb，輔助氣為15 arb，吹掃氣為1 arb，噴霧電壓為3.2 kV，毛細(xì)管溫度為350 ℃，碰撞誘導(dǎo)解離能量為60%。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用SIVE軟件（Thermo公司）對(duì)LC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理及歸一化，并在Excel 2007軟件中進(jìn)行編輯，將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件（版本13.0）進(jìn)行主成分分析（PCA）。

1.2.3 根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌的抑菌活性分析。

將LC-MS檢測(cè)結(jié)果含量較高的根系分泌物溶于燕麥培養(yǎng)基中，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)煙草疫霉菌抑菌活性[14]。分別配制成濃度為500 μg/mL的含藥培養(yǎng)基，再在固體培養(yǎng)基上接菌，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)情況。預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)根系分泌物中對(duì)煙草疫霉菌菌絲有明顯抑制作用的有12種物質(zhì)。

1.2.4 典型根系分泌物有效抑制濃度的篩選。

將12種根系分泌物分別配制成濃度為1、10、100、800、1 500 μg/mL的溶液，溶液經(jīng)過(guò)除菌過(guò)濾器過(guò)濾，與燕麥培養(yǎng)基按體積1∶9混合，再在固體培養(yǎng)基上接種，28 ℃培養(yǎng)3 d后測(cè)量菌落直徑，每次處理重復(fù)4次。預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，12種根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌菌絲的抑制作用明顯的濃度為100～800 μg/mL。

1.2.5 典型根系分泌物的抑菌效應(yīng)。

將12種根系分泌物配制成濃度為0（CK）、100、400和800 μg/mL的溶液，溶液經(jīng)過(guò)除菌過(guò)濾器過(guò)濾，與燕麥培養(yǎng)基按體積1∶9混合，再在固體培養(yǎng)基上接種，28 ℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑，每次處理重復(fù)4次。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算不同處理對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

菌落直徑=測(cè)量菌落平均值-0.5（菌片直徑）

煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制率=（1-處理菌落直徑/對(duì)照菌落直徑）×100%

采用Excel和DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行毒力計(jì)算，抑菌率換算成概率值，質(zhì)量濃度以對(duì)數(shù)值表示，以各物質(zhì)不同質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（x）和菌落生長(zhǎng)抑制率的概率值（y）求取毒力回歸方程y=a+bx以及相關(guān)系數(shù)，并計(jì)算抑菌中濃度（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根系分泌物的成分分析

LC-MS結(jié)果（圖1）表明，革新3號(hào)根系分泌物主要包括烴類、苯、噻唑、酸、酮、酰胺、酯、醇和酚，其中噻唑、酰胺為首次報(bào)道的煙草根系分泌物。水溶性有機(jī)酸、長(zhǎng)鏈脂肪酸、苯甲酸的衍生物、醇、脂肪簇醛、酮、苯、酚、烴類及其衍生物等低分子有機(jī)化合物則是常見的煙草根系分泌物。

2.2 根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

32種根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)作用結(jié)果見表2。在濃度為500 μg/mL時(shí)，12種根系分泌物酒石酸、棕櫚酸、油酸、水楊酸、亞麻酸、2-呋喃甲酸、茉莉酮、6，7-二羥基香豆素、二硝托胺、丁酰乳酸乙酯、三丁酸甘油酯和土木香內(nèi)酯對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率均>30%，抑制率依次為91.19%、30.89%、30.77%、88.05%、30.16%、82.19%、44.29%、78.45%、49.18%、45.21%、33.60%和87.09%。5種根系分泌物纈草酸、對(duì)庚氧基苯甲酸、三丙酸甘油酯、2-乙酰基吡咯、6-姜酚均促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。其他物質(zhì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)作用不顯著。綜上，在煙草根系分泌物中，有抑制煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的化合物，也有促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的化合物。將12種抑制煙草疫霉菌的根系分泌物作為典型根系分泌物，進(jìn)一步研究其對(duì)菌絲的抑制作用。

2.3 典型根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌的抑菌效應(yīng)

由表3可知，與對(duì)照相比，12種根系分泌物均顯著抑制煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)。從處理濃度對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率效應(yīng)來(lái)看，隨著濃度的提高，其抑制效果也越來(lái)越明顯。在低濃度（100 μg/mL）條件下，酒石酸、6，7-二羥基香豆素和土木香內(nèi)酯的抑制率分別為33.71%、22.32%和22.31%，以酒石酸的抑菌效果最好。在高濃度（800 μg/mL）的條件下，酒石酸、水楊酸、2-呋喃甲酸和土木香內(nèi)酯的抑制率分別為92.87%、97.14%、91.33%和93.76%，以水楊酸的抑菌效果最好。

2.4 對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的毒力分析

由表4可知，12種根系分泌物處理濃度與菌絲生長(zhǎng)的抑制率均呈線性關(guān)系。EC50值是衡量殺菌劑毒力的指標(biāo)，值越小表示其毒力越強(qiáng)。酒石酸、水楊酸、2-呋喃甲酸、6，7-二羥基香豆素、土木香內(nèi)酯的EC50值均小于500 μg/mL。其中，酒石酸的毒力最強(qiáng)，EC50值為159.68 μg/mL，表明其對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好。

3 結(jié)論與討論

煙草根系分泌物種類復(fù)雜，其中一些物質(zhì)具有生物活性。煙草革新3號(hào)根系分泌物主要為烴類、苯、噻唑、酸、酮、酰胺、酯、醇和酚等。利用LC-MS技術(shù)明確煙草革新3號(hào)根系分泌物的主要組成。其中，酒石酸、棕櫚酸、油酸、水楊酸、亞麻酸、2-呋喃甲酸、茉莉酮、6，7-二羥基香豆素、二硝托胺、丁酰乳酸乙酯、三丁酸甘油酯和土木香內(nèi)酯12種根系分泌物對(duì)煙草疫霉菌具有顯著的抑制效應(yīng)，對(duì)疫霉菌抑制率在30%以上。在高濃度（800 μg/mL）的條件下，酒石酸、水楊酸、2-呋喃甲酸和土木香內(nèi)酯的抑制率分別為92.87%、97.14%、91.33%和93.76%，以水楊酸的抑菌效果最好。EC50的使用濃度分別為159.68、257.02、227.03、202.28 μg/mL，均小于500 μg/mL。這說(shuō)明煙草根系分泌物中的一些物質(zhì)在防治土壤病害方面的效果良好，其原因可能與該類物質(zhì)對(duì)煙草疫霉菌具有較強(qiáng)的熏蒸和殺生作用有關(guān)[15]。

在自然環(huán)境中，根系分泌物中的不同物質(zhì)產(chǎn)生累加效應(yīng)，其抑菌作用由綜合效應(yīng)加以確定[16-17]。根系分泌物抑菌試驗(yàn)表明，根系分泌物中少數(shù)化合物對(duì)土傳病害病原菌繁殖或孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用[18]，其生物活性也隨著化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同而存在差異；而有些化合物對(duì)病原菌的繁殖和孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，這與根系分泌物中氨基酸、多糖、脂類等成分為土傳病原菌提供生存所必需的碳源和氮源有密切關(guān)系[19]。該研究結(jié)果對(duì)篩選抗病品種與控制煙草疫霉菌病害的發(fā)生具有重要意義。

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