賽山梅種子萌發(fā)期生理生化特性研究

凃峰 萬俊鵬 胡永清 喻方圓

摘要 [目的]研究賽山梅（Styrax confusus）種子萌發(fā)生理生化特性。[方法]對賽山梅種子萌發(fā)期生理生化指標(biāo)變化進(jìn)行測定，包括貯藏營養(yǎng)物質(zhì)含量以及相關(guān)酶活性。[結(jié)果]賽山梅種子萌發(fā)初始階段可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢，可溶性糖含量先上升后下降，淀粉酶活性先上升后下降趨于平緩，同時淀粉含量不斷下降，過氧化物酶活性在萌發(fā)后期明顯升高。賽山梅種子萌發(fā)初期淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性糖和蛋白質(zhì)，種子代謝活性顯著提高。[結(jié)論]該研究為揭示賽山梅種子萌發(fā)期的代謝規(guī)律，促進(jìn)賽山梅種子迅速整齊萌發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 賽山梅；種子；萌發(fā)期；生理生化指標(biāo)

中圖分類號 S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0108-03

Abstract [Objective]To reveal the physiological and biochemical characteristics of Styrax confuses seeds during the germination stage.[Method]The changes of physiological and biochemical indexes in the germination period of S. confusus were measured， including the contents of nutrients and the activity of related enzymes.[Result]The soluble protein content in the initial stage of seed germination was on the rise.The soluble sugar content increased first and then decreased.The activity of amylase decreased gradually and the starch content decreased. Peroxidase activity increased significantly in the late stage of germination.Starch of S. confusus seeds transformed to soluble sugar and protein during the initial stage of germination and metabolic activities of the seeds significantly increased.[Conclusion]This study provided a scientific basis for revealing the metabolic regularity of the seeds germination period and promoting the rapid and orderly germination of S. confusus seeds.

Key words Styrax confusus；Seeds；Germination stage；Physiological and biochemical index

種子植物個體發(fā)育中最為關(guān)鍵的時期就是種子的萌發(fā)期，種子植物開始生長的標(biāo)志就是種子萌發(fā)。它是植物自身為了繁殖而形成的一種生物學(xué)特性，目的是用來適應(yīng)環(huán)境（氣候變化、溫度差異等因素），對于種群能夠順利繁衍和進(jìn)化具有非常重要的生物學(xué)意義[1]。種子萌發(fā)問題一直是人們重點(diǎn)研究的問題之一。目前關(guān)于種子萌發(fā)的研究重點(diǎn)集中在蔬菜和農(nóng)作物上，而對于林木的研究開展較少，且主要針對胚根突破種殼之后的時期，即萌發(fā)后期，對干燥種子吸水至胚根突破種殼的詳細(xì)代謝過程[2]卻很少關(guān)注。針對存在的這些問題，擬采用賽山梅（Styrax confusus）種子研究萌發(fā)初始階段胚乳的代謝過程，詳細(xì)了解初始階段不同代謝時期的起始點(diǎn)及種胚內(nèi)含物和淀粉酶等生理指標(biāo)在各時期的變化，為其他林木種子萌發(fā)初始階段的研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 種子來源及處理

賽山梅種子種源為江西省龍南縣，采種時間為2015年10月。將新采集的種子在3～5 ℃的低溫下濕沙層積處理90 d后取出進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2 種子發(fā)芽試驗(yàn) 層積結(jié)束后，于2016年3月將種子用自來水沖洗干凈，選取飽滿健康、大小一致的種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，具體步驟如下：通過四分法選取50粒種子，播種于盛有濕沙的發(fā)芽盒中，放入培養(yǎng)箱[（25±1）℃]中發(fā)芽，重復(fù)6次（其中2次重復(fù)用于生化測定取樣）。每隔3～5 d噴水保持沙的濕潤。

1.3 測定方法

1.3.1 種子發(fā)芽率測定。根據(jù)《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GB2772—1999）[3]要求的方法，間隔5 d觀察1次種子發(fā)芽情況，第30天結(jié)束發(fā)芽。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測定。置床后每隔5 d取樣，樣品保存在-70 ℃冰箱中，發(fā)芽結(jié)束后，敲去種殼統(tǒng)一測定。可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定；可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮比色法測定；α+β淀粉酶、α淀粉酶及β淀粉酶活性采用水楊酸法[4]測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[5]測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和整理，采用SAS 9.3進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤和進(jìn)行多重比較。多重比較的顯著性用P表示，當(dāng)P<0.01時，存在極顯著差異；當(dāng)P<0.05時，存在顯著差異；當(dāng)P>0.05時，差異不顯著。圖表的制作用Microsoft Excel 2013軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

從圖1可以看出，置床后15 d內(nèi)賽山梅種子內(nèi)可溶性蛋白含量上升；置床后15～20 d略有下降；置床后20～30 d可溶性蛋白含量上升，且上升趨勢大于前15 d。賽山梅種子在種子萌發(fā)的30 d中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升后平穩(wěn)再上升的趨勢。

2.2 可溶性糖含量的變化

從圖2可以看出，賽山梅種子內(nèi)可溶性糖含量在置床后25 d內(nèi)呈上升趨勢，置床后25～30 d可溶性糖含量急劇下降，總體為先上升后急劇下降的趨勢，這可能是前期種子內(nèi)淀粉、脂肪等大分子物質(zhì)被用來提供能量，可溶性糖被利用較少的緣故，而到25 d時種胚代謝加強(qiáng)，可溶性糖作為能源物質(zhì)被大量消耗，其含量大幅度下降。賽山梅種子種胚的可溶性糖含量在萌發(fā)初期的變化規(guī)律與油松種子的研究結(jié)果相似[6]：可溶性糖被直接作為原料物質(zhì)利用。置床時間越長，種子內(nèi)代謝越旺盛。

2.3 淀粉含量的變化 從圖3可以看出，賽山梅種子中淀粉含量隨著培養(yǎng)時間的延長不斷降低。在置床后15 d內(nèi)淀粉含量下降較快，從300 mg/g降低至約150 mg/g，之后15 d下降緩慢，逐漸趨于平穩(wěn)，從150 mg/g降低至100 mg/g左右。賽山梅種子內(nèi)淀粉含量總體呈下降逐漸趨于平穩(wěn)態(tài)勢。賽山梅種子種胚的淀粉含量在萌發(fā)初期的變化規(guī)律表明：培養(yǎng)初期階段在淀粉水解酶的作用下淀粉被水解為可溶性碳水化合物。

2.4 淀粉酶活性的變化

從圖4可以看出，置床后10 d內(nèi)賽山梅種子胚中α+β淀粉酶、α淀粉酶及β淀粉酶的活性均呈上升趨勢；10～20 d均呈下降趨勢；20～30 d總體趨于平緩。發(fā)芽時間內(nèi)總體表現(xiàn)出先升高后降低，最終趨于平緩的趨勢，并且α淀粉酶活性升高的幅度明顯高于β淀粉酶。這與油松種子[6]的研究結(jié)果相同。

從圖4還可以看出，總淀粉酶活性在置床10 d內(nèi)上升趨勢明顯，活性最高達(dá)8.0 mg/（g·min），與上述淀粉含量的變化相互對應(yīng)，淀粉酶活性升高，則淀粉降解快，淀粉含量下降明顯，后兩者均有趨于平緩的趨勢。這說明在種子萌發(fā)的0～10 d代謝活動較強(qiáng)，胚生長需要大量的能量和原料，貯藏淀粉迅速降解，α淀粉酶、β淀粉酶及α+β淀粉酶活性隨之大幅度升高，與馬尾松種子[7]研究結(jié)果相同。

2.5 過氧化物酶活性的變化

從圖5可以看出，置床后10 d內(nèi)過氧化物酶活性略有上升，在10～25 d時快速下降，30 d時其活性達(dá)到最高，大約是萌發(fā)初的2倍，達(dá)0.35 U/g。賽山梅種子內(nèi)過氧化物酶活性總體呈先上升后下降最后再上升的趨勢。

3 討論與結(jié)論

3.1 貯藏營養(yǎng)物質(zhì)含量及酶活性的變化

種子內(nèi)各種生理活動都需能量來支持，尤其是在種子萌發(fā)初始階段，需要大量的能量和原料用于初始階段旺盛的生命活動，例如新器官和新組織的合成。因而在萌發(fā)初始階段形成了以水解為主，呼吸作用強(qiáng)烈進(jìn)行的代謝特點(diǎn)[8]。種子內(nèi)大量可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白等貯藏物質(zhì)被用來參與該階段的生理活動，一方面被水解生成易被胚吸收的小分子物質(zhì)，從種胚運(yùn)送到胚軸；另一方面為胚細(xì)胞的生命活動提供碳源和氮源，有利于胚的生長[9]。

通過對賽山梅種子萌發(fā)初始階段種胚能量代謝、物質(zhì)代謝等方面的研究，基本揭示了經(jīng)過低溫層積處理后賽山梅種子萌發(fā)初始階段的代謝機(jī)理。研究結(jié)果表明：①賽山梅種子在種子萌發(fā)的30 d中可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢，在萌發(fā)的前15 d含量趨于平衡，15～20 d時有明顯下降。這個階段代謝較強(qiáng)，可能是可溶性蛋白被大量水解成氨基酸的緣故。

②種胚中可溶性糖含量在種子萌發(fā)開始的一段時間略有上升，后呈急劇下降的趨勢，表明可溶性糖被直接作為原料物質(zhì)利用。在一段時間內(nèi)置床時間越長，種子內(nèi)代謝越旺盛。③賽山梅種子在置床的前15 d內(nèi)淀粉含量下降較快，說明培養(yǎng)初期在淀粉水解酶的作用下淀粉被水解為可溶性的碳水化合物，供應(yīng)胚的生長。④賽山梅種子種胚中淀粉含量和淀粉酶呈負(fù)相關(guān)。隨著淀粉酶活性的增強(qiáng)，種子內(nèi)淀粉含量下降更快。

3.2 過氧化物酶活性的變化

相關(guān)研究表明，超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性的高低與種子活力呈正相關(guān)[10]。該研究發(fā)現(xiàn)，在整個萌發(fā)初始階段，過氧化物酶活性呈現(xiàn)先上升后下降最后急劇上升的趨勢，意味著細(xì)胞活動增強(qiáng)導(dǎo)致有害物質(zhì)增多，保護(hù)酶活性逐步降低，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除已處于不穩(wěn)定狀態(tài)，嚴(yán)重影響種子的萌發(fā)，后逐漸趨于正常萌發(fā)，代謝加強(qiáng)，有害物質(zhì)減少，最終過氧化物酶活性增強(qiáng)，與該研究中賽山梅種子萌發(fā)的動態(tài)變化相一致。作為種子生活力與活力強(qiáng)弱的參考指標(biāo)，過氧化物酶這種與內(nèi)源保護(hù)反應(yīng)相關(guān)的酶是在種子萌發(fā)的中后期才明顯啟動，其活性隨胚的萌動與生長而提高，以增強(qiáng)其對活性氧的清除和抗逆能力。過氧化物酶是參與種子萌發(fā)的重要酶類。很多研究表明，過氧化物酶活性都隨著種子萌發(fā)而迅速增加[11-12]。賽山梅種子在萌發(fā)過程中，過氧化物酶活性逐漸增強(qiáng)，加速了向PPP途徑的轉(zhuǎn)化，這與山楂種子[13]的研究結(jié)論相似，萌發(fā)時過氧化物酶活性提高有利于PPP途徑，促進(jìn)種子休眠的解除。

參考文獻(xiàn)

[1] 烏鳳章，劉桂豐，姜靜，等.種子萌發(fā)調(diào)控的分子機(jī)理研究進(jìn)展[J].北方園藝，2008（2）：54-58.

[2] 鄭光華，史忠禮，趙同芳，等.實(shí)用種子生理學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1990.

[3] 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.林木種子檢驗(yàn)規(guī)程：GB 2772—1999[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000.

[4] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2004.

[5] 黃學(xué)林，陳潤政.種子生理實(shí)驗(yàn)手冊[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1990.

[6] 陳麗培. 油松種子萌發(fā)初始階段生理生化特性研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué)，2009.

[7] 任淑娟. 馬尾松種子萌發(fā)初期的細(xì)胞周期和生理特性的研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué)，2010.

[8] 柴家榮.白肋煙種子萌發(fā)的生理生化動態(tài)研究[J].中國煙草科學(xué)，2006（2）：32-36.

[9] KHAN A A. Primary， preventive and permissive role of hormones in plant systems[J].The botanical review， 1975，41（4）：391-420.

[10] MAJOR W，ROBERTS E H. Dormancy in cereal seeds： II. The nature of the gaseous exchange in imbibed barley and rice seeds [J]. Journal of experimental botany， 1968，19（58）：90-101.

[11] 董建華，崔德才，邵宗澤，等.薏苡種子萌發(fā)過程中盾片上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化及酸性磷酸酶的動態(tài)[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1996，29（1）：71-79.

[12] 蔣躍明，陳芳，李月標(biāo)，等.板栗種子萌發(fā)過程中生理生化特性的探討[J].廣東林業(yè)科技，1995，11（3）：15-17.

[13] 張培玉，楊曉玲，頂?shù)罘?，? 山楂種子休眠和萌發(fā)與內(nèi)源激素含量的變化[C]//中國園藝學(xué)會.中國園藝學(xué)會成立70周年紀(jì)念優(yōu)秀論文選編.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1999：4.