春蘭SRAP—PCR反應體系的建立與優(yōu)化

袁媛　孫葉　李風童　包建忠　陳秀蘭

摘要 [目的]構建適合春蘭SRAP-PCR反應的最佳體系。[方法]對影響PCR反應的5個變量（dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶量、模板DNA用量）采用L16（45）正交試驗設計，建立春蘭SRAP-PCR最適反應體系。[結果]最佳優(yōu)化體系為0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA，共20 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min，反應前5個循環(huán)在94 ℃變性1 min、35 ℃復性1 min、72 ℃延伸1 min的條件下運行，隨后的30個循環(huán)復性溫度提高至50 ℃，最后72 ℃延伸10 min。[結論]該體系有利于SRAP分子標記在春蘭材料上的應用，為春蘭分子遺傳育種奠定了基礎。

關鍵詞 春蘭；SRAP-PCR；正交試驗設計；體系優(yōu)化

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0105-03

Abstract [Objective]To establish the suitable SRAPPCR reaction system for Cymbidium goeringii .[Method] L16（45） of orthogonal design was used to optimize SRAPPCR of C. goeringii in 5 factors such as dNTPs concentration， Mg2+ concentration， primer concentration， Taq DNA polymerase amount and DNA template amount. [Result]The optimized system was as follows： a total volume of 20 μL including 0.25 mmol/L dNTPs， 2.50 mmol/L Mg2+， 0.80 μmol/L primer， 1.00 U Taq DNA polymerase， 200.00 ng DNA template. The suitable SRAPPCR procedure was 4 min of denaturing at 94 ℃， five cycles of three steps， 1 min of denaturing at 94 ℃， 1 min of annealing at 35 ℃ and 1 min of elongation at 72 ℃， in the following 30 cycles， the annealing temperature was increased to 50 ℃， with a final elongation step of 10 min at 72 ℃. [Conclusion]The SRAPPCR reaction system for SRAP markers of C. goeringii could be applied in C. goeringii molecular genetics research.

Key words Cymbidium goeringii；SRAPPCR；Orthogonal experiment design；Optimization of reaction system

蘭科（Orchidaceae）是開花植物中最大科之一，擁有25 000多個種[1]。春蘭（Cymbidium geringii）屬于蘭科蘭屬多年生草本植物，其花幽香，葉姿秀美，具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。長期的自然雜交和人工選育使得各變種及自然雜交種不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的鑒定方法已不能較為系統(tǒng)地鑒定春蘭品種間的親緣關系。僅憑葉色、葉型、花色、花型和花梗等傳統(tǒng)形態(tài)指標來辨識品種存在很大難度，也影響新品種的注冊登錄和產(chǎn)權保護[2]。因此，利用分子標記技術研究春蘭分類及種質資源遺傳多樣性評價就顯得相當必要。

序列相關擴增多態(tài)性標記（sequence related amplified olymorphism，SRAP）是Li和Quiros發(fā)展的一種新的分子標記技術[3]，具有簡便、快捷、穩(wěn)定、高效、共顯性高及在基因組中分布均勻等特點。它針對基因外顯子富含GC而啟動子和內含子富含AT的特點來設計引物進行擴增，因不同個體以及物種的內含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[4]。目前該技術已成功應用于對水稻[5]、小麥[6]、甜瓜[7]、野牛草[8]、辣椒[9]、棉花[10]等植物的研究中。該研究采用正交試驗設計，對影響春蘭SRAP-PCR反應體系的dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶和模板DNA用量這5個因素進行優(yōu)化試驗，旨在建立適用于春蘭的SRAP-PCR反應體系，為今后進一步利用SRAP分子標記開展蘭花種質資源鑒定和遺傳圖譜構建等研究工作打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所花圃中的春蘭嫩葉為試材，取樣后-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)前期試驗，引物Me1/Em7（Me1：5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′，Em7：5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′）對春蘭具有良好的條帶可讀性和多態(tài)性，故選其為此次正交試驗的固定引物。

1.2 DNA提取和質量檢測

采用改良的CTAB法提取基因組DNA[11]，溶解于TE溶液。DNA的濃度和純度測定使用OneDrop1000超微量分光光度計，選用OD260/OD280在1.7～1.9的DNA，將DNA稀釋至所需的濃度（50 ng/μL），-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應體系正交設計

選用L16（45）正交設計表，對影響PCR反應體系的5個主要因素（dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶和模板DNA用量）在4個水平上進行試驗，PCR反應因素水平見表1，L16（45）設計方案見表2。SRAP-PCR反應體系共20 μL，包括5個因素的不同水平，每個體系添加2.00 μL的10×Buffer，加ddH2O至終體積。正交設計共16個處理，每個處理3次重復。

1.4 SRAP-PCR的擴增及檢測

SRAP-PCR擴增反應在Agilent Sure Cycler 8800 PCR儀中進行。擴增程序如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖（含溴化乙錠）電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE，90 V穩(wěn)壓1 h，于凝膠成像儀上觀察并照相記錄。

1.5 最佳反應體系的檢測

選取Me1/Em7和Me11/Em8（Me11：5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′，Em8：5′- GACTGCGTACGAATTCA-3′）對16份春蘭材料進行PCR擴增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并染色后，在紫外成像系統(tǒng)上拍照檢測，來驗證反應體系的穩(wěn)定性和可行性。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

采用不同的反應體系，春蘭基因組DNA的SRAP-PCR擴增電泳圖譜見圖1。從圖1可以看出，不同dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶量和模板DNA用量的16個反應體系，擴增結果存在明顯差異。第1、5、9、13和14號反應體系無擴增；第6、15、16號反應體系擴增條帶模糊，彌散嚴重；第2、3、4、7、8和10號反應體系擴增條帶中有1條較亮，其他條帶較弱且模糊不清晰；第11號反應體系擴增條帶較多，強弱均勻且清晰可辨，是比較理想的擴增模式。綜上所述，選定第11號反應體系（含0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA）作為春蘭基因組DNA的SRAP-PCR反應體系。

2.2 優(yōu)化的反應體系穩(wěn)定性

應用該最佳反應體系，利用引物Me1/Em7和Me11/Em8 對16份春蘭材料進行SRAP-PCR擴增，得到清晰、多態(tài)性高的SRAP譜帶（圖2），且具有較好的穩(wěn)定性。說明該體系較穩(wěn)定，適用于春蘭SRAP-PCR反應。

3 討論

SRAP是一種基于PCR的新型分子標記，最早是在蕓薹屬作物中開發(fā)出來的，現(xiàn)已成功應用在多種作物的種質資源鑒定、遺傳圖譜構建、比較基因組學研究等方面[12]。SRAP標記正向引物可特異結合開放閱讀框（ORF）區(qū)域中的外顯子，反向引物可特異結合啟動子和內含子區(qū)域，由于不同個體及物種內含子、啟動子間間隔長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[13]。SRAP比RAPD重復性、穩(wěn)定性好，與AFLP相比，操作簡便、成本更低，相比SSR標記開發(fā)簡單[14]，但同樣受到反應條件和擴增程序變化的影響，因此有必要對春蘭基因組DNA的SRAP-PCR反應條件進行優(yōu)化。

筆者采用正交試驗方法，建立了春蘭SRAP-PCR的反應體系：0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA，共20 μL。同時，利用2對引物對16份春蘭材料進行擴增，檢驗了該SRAP-PCR反應體系的穩(wěn)定性。春蘭SRAP-PCR優(yōu)化體系的建立為以后應用SRAP分子標記研究蘭花資源及其他近緣種的遺傳多樣性提供了參考。

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