立達(dá)霉在草魚體內(nèi)的代謝機(jī)制研究

呂新美　楊宗英　姜鶯穎　董亞萍　胡鯤　楊先樂

摘要[目的]研究立達(dá)霉在草魚體內(nèi)的代謝機(jī)制。[方法]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測方法，檢測草魚在立達(dá)霉單次口灌200mg/kg，浸泡9mg/L劑量條件下，其肝臟組織中立達(dá)霉原藥含量及代謝產(chǎn)物的種類，研究立達(dá)霉在草魚肝臟組織中的代謝機(jī)制。[結(jié)果]在口灌組及浸泡組，肝臟組織中的立達(dá)霉以原藥（M0）為主，高于75.00%；立達(dá)霉在草魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要有4種，分別為代謝物N-（2-羧基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸、N-[（2-羥甲基）-6-甲苯基]-N-（羥乙?；┍彼帷-（2，6-二甲苯基）-N-（羥乙?；┍彼岷蚇-（2-羥甲基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸甲酯，各代謝產(chǎn)物所占比例均小于10.00%。[結(jié)論]立達(dá)霉在草魚肝臟組織中殘留應(yīng)以立達(dá)霉原藥作為殘留檢測標(biāo)識物。

關(guān)鍵詞 立達(dá)霉；草魚；代謝；殘留；標(biāo)識物

中圖分類號 S948 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）11-0161-03

立達(dá)霉（Ridomil）是Ciba—Geigy公司（瑞士）的Schwinn于1977年首先報(bào)導(dǎo)的新型高效內(nèi)吸殺菌劑，其通用名稱為metalaxyl（英國標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會認(rèn)可、國際標(biāo)準(zhǔn)化組織建議），代號為CGA48988。立達(dá)霉屬于苯甲酰胺類農(nóng)藥，常用作系統(tǒng)性真菌劑，用于作物的病原性真菌防治，效果良好。立達(dá)霉中文商品名為瑞毒霉、甲霜安、瑞多霉、甲霜靈、阿普隆、保種靈、瑞毒霜、雷多米爾、氨丙靈等，可用于馬鈴薯、葡萄、煙草、酒花、玉米、小米、高粱、棉花等多種農(nóng)作物，作為葉面噴霧、拌種和土壤處理藥劑。在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐中也常被用于防治水產(chǎn)動物由水霉菌引起的疾病，其對卵菌綱有較強(qiáng)的防治效果。

目前關(guān)于立達(dá)霉代謝產(chǎn)物的研究主要集中在其藥物殘留檢測上，如立達(dá)霉在水稻、西瓜、煙葉、馬鈴薯等作物上的殘留消除規(guī)律。在這些研究中藥物殘留檢測的標(biāo)識物為立達(dá)霉的原藥。而是否應(yīng)該以立達(dá)霉作為檢測標(biāo)識物的文章鮮見發(fā)表。筆者以草魚為對象，利用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用的方法，檢測立達(dá)霉在草魚肝臟組織中的代謝情況，為確立立達(dá)霉在草魚體內(nèi)的殘留檢測標(biāo)識物提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備 Aglient-1100型高效液相色譜儀配自動進(jìn)樣器和熒光檢測器（美國Aglient公司）；APl4000Q-trap液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）配TurboI-onSpray離子源，Analyst1.5.1軟件；TurboV印LV型吹氮濃縮儀（美國Zymark公司）；T25型均質(zhì)器（德國IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AT204-IC型分析天平（瑞士梅特勒公司）精密電子天平；渦旋振蕩器；超聲波清洗儀；微孔濾膜（0.22μm，頗爾，Whatman，美國）。

1.2藥品與試劑 立達(dá)霉原料藥由長沙拜特生物科技研究所有限公司提供。立達(dá)霉對照品購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，德國Dr.Ehrenstorfer，CAS編號57837-19-1（水分含量0.1%，檢測純度為99%，耐受性/不確定性±0.5%，卡爾·費(fèi)歇爾滴定法測定）。甲酸、甲醇、甲醛均為色譜純。

1.3養(yǎng)殖條件 試驗(yàn)用健康草魚均購自上海浦東孫農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖場，平均體重為（250±10）g，將草魚放置于提前用高錳酸鉀消毒后的水族箱（100cm×80cm×50cm）中暫養(yǎng)7d，暫養(yǎng)期間每2d換1次水，每次換水量為1/3。試驗(yàn)用水為充分曝氣后的自來水，充氣泵持續(xù)進(jìn)行充氧。試驗(yàn)期間使用加熱棒進(jìn)行控溫，水溫為（25±1）℃。

1.4方法

1.4.1給藥方式和取樣。試驗(yàn)用草魚共1080尾，隨機(jī)分為3組，每組3個重復(fù)，1組空白對照，1組口灌，1組浸泡。在給藥前采集空白肝臟組織，口灌組以200mg/kg的劑量進(jìn)行口灌，無回吐者保留試驗(yàn)；浸泡組以9mg/L的濃度進(jìn)行浸泡?？诠嗪徒萁M，在給藥3h后分別取肝臟組織樣品，并將取得的樣品置于-80℃下保存。

1.4.2樣品的前處理。

1.4.2.1提取。將樣品從低溫冰箱中取出，置于室溫解凍。準(zhǔn)確稱取5g肝臟勻漿組織于50mL離心管中，加入20mL甲醇，渦旋振蕩5min，8000r/min離心10min，取上清液置于另1個干凈的100mL離心管中；用20mL甲醇重復(fù)提取1次后，合并上清液，在合并的上清液中加入40mL正己烷，渦旋振蕩后，靜置10min，取下層清液，待凈化。

1.4.2.2凈化。C₁₈固相萃取小柱凈化；加3mL的乙腈活化固相萃取小柱；用3mL的水淋洗，除去小柱內(nèi)原有的雜質(zhì)；將待凈化的樣品提取液加入固相萃取小柱；再用3mL的水淋洗，除去小柱內(nèi)殘留的雜質(zhì)；最后用3mL的乙腈將藥物從小柱內(nèi)洗脫下來，待濃縮。

1.4.2.3濃縮。將洗脫液用N₂在30℃條件下吹干，再用1mL流動相充分溶解，經(jīng)O.45μm微孔濾膜過濾，上機(jī)測定。

1.4.3HPLC參數(shù)。色譜柱：反相色譜柱C₁₈柱（4.6mm×250mm），柱溫30℃，流動相：0.1%的甲酸水溶液（A）和10%（V/V）甲醇甲醛溶液（B），洗脫梯度如下：0～0.5min，5%B；>0.5～2.0min，5%～25%B；>2.0～3.0min，25%～80%B；>3.O-4.0min，80%～95%B。檢測波長210nm，流速0.3mL/min，進(jìn)樣量5μL。

1.4.4質(zhì)譜參數(shù)。離子源為電噴霧電離源，采用正離子檢測模式，干燥氣體N₂，溫度為350℃，流速為10L/min；霧化氣體N₂，霧化器壓力為2.8×10⁵Pa；鞘氣氣體N2，溫度為360℃，流速為12L/min；毛細(xì)管電壓為4000V，噴嘴電壓為0V。

1.4.5代謝產(chǎn)物分析。準(zhǔn)確稱取5g肝臟勻漿組織，分別按樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析。給藥組及空白組樣品均分別在正、負(fù)離子下采用一級掃描（m/z100～1000）獲得總離子流圖。比較給藥組及空白組總離子流圖，鑒別出代謝產(chǎn)物色譜峰及其準(zhǔn)分子離子。分別對其準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜破碎，獲得二級質(zhì)譜圖，結(jié)合其準(zhǔn)分子離子信息、二級離子碎片信息以及原形化合物結(jié)構(gòu)，對代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1草魚體內(nèi)立達(dá)霉及其代謝產(chǎn)物的HPLC-MS/MS定性分析 在給藥后的草魚肝臟中共發(fā)現(xiàn)7個具有給藥依賴性的色譜峰，其中選擇測定的標(biāo)記為（M0～M4）。肝臟樣品中立達(dá)霉及其代謝產(chǎn)物的色譜見圖1。從色譜圖上可以看出，原藥M0在魚體內(nèi)被分解代謝所占比例較低，產(chǎn)生的6種主要代謝產(chǎn)物中M3相對較高，提示生成M3的通路可能是立達(dá)霉代謝的重要途徑。

2.1.1原藥M0的HPLC—MS/MS分析。在一級負(fù)離子全掃描質(zhì)譜中觀察到其準(zhǔn)分子離子為m/z279.1471，色譜保留時(shí)間為9.6min時(shí)出現(xiàn)一個色譜峰（圖2），命名為M0，又對其進(jìn)行色譜行為、準(zhǔn)分子離子質(zhì)荷比以及碎片離子分析，其均與立達(dá)霉對照品一致，據(jù)此確定M0是未被代謝的原藥。

2.1.2代謝產(chǎn)物M1的HPLC-MS/MS分析。在一級負(fù)離子全掃描質(zhì)譜中觀察到其準(zhǔn)分子離子為m/z472.1813，色譜保留時(shí)間為7.1min（圖2），命名為M1。二級全掃描質(zhì)譜中觀察到m/z472.1802的碎片離子（圖3），經(jīng)分析為準(zhǔn)分子離子由于質(zhì)量數(shù)為176u的中性丟失生成，故推測其為葡萄糖醛酸苷。由于M1較立達(dá)霉（m/z2401.3000）質(zhì)量數(shù)多192，推測其為立達(dá)霉氧化后又發(fā)生葡萄糖苷醛酸化的產(chǎn)物，為N-（2，6-二甲苯基）-N-（羥乙酰基）丙氨酸。

2.1.3代謝產(chǎn)物M2的HPLC-MS/MS分析。在一級負(fù)離子全掃描質(zhì)譜中觀察到其準(zhǔn)分子離子為m/z296.1493，色譜保留時(shí)間為7.9～8.2min（圖2），命名為M2，其是所有代謝產(chǎn)物中質(zhì)譜響應(yīng)較高的產(chǎn)物。二級全掃描質(zhì)譜中觀察到m/z296.1450（圖3）的碎片離子，由于m/z196.1450較立達(dá)霉準(zhǔn)分子量多16，推測M2為立達(dá)霉的氧化產(chǎn)物，為N-（2-羥甲基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙?；┍彼峒柞?。

2.1.4代謝產(chǎn)物M3的HPLC-MS/MS分析。在一級負(fù)離子全掃描質(zhì)譜中觀察到其準(zhǔn)分子離子為m/z252.1230，色譜保留時(shí)間為8.4min（圖2），命名為M3。進(jìn)一步的二級質(zhì)譜碎裂模式中，觀察到碎片離子m/z252.1220（圖3）較立達(dá)霉準(zhǔn)分子量少28，推測其為立達(dá)霉的雙脫甲基產(chǎn)物，推測M3為立達(dá)霉經(jīng)過雙脫甲基代謝產(chǎn)物，為N-（2-羧基-6-苯甲基）-Nv（甲氧乙?；┍彼?。

2.1.5代謝產(chǎn)物M4的HPLC-MS/MS分析。在一級負(fù)離子全掃描質(zhì)譜中觀察到其準(zhǔn)分子離子為m/z266.1387，色譜保留時(shí)間為9.0min（圖2），命名為M4。在準(zhǔn)分子離子的二級全掃描質(zhì)譜中準(zhǔn)分子量為m/z266.1404（圖3）。由于M4較立達(dá)霉準(zhǔn)分子量少14，推測其為立達(dá)霉的單脫甲基產(chǎn)物，為N-[（2-羥甲基）-6-甲苯基]-N-（羥乙?；┍彼?。

2.2草魚體內(nèi)立達(dá)霉代謝產(chǎn)物的定量分析 在浸泡、灌胃給藥立達(dá)霉3h后，取草魚肝臟樣品，分析各種產(chǎn)物的峰面積比例（表1）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在浸泡組及口灌組中，肝臟組織中的立達(dá)霉以原藥（MO）為主，其峰面積所占比例分別為76.62%、75.65%，均高于75.00%，在浸泡組其代謝產(chǎn)物M1、M2、M3、M4峰面積所占比例分別為1.64%、6.24%、8.87%、1.94%；而在口灌組，立達(dá)霉代謝產(chǎn)物M1、M2、M3、M4峰面積所占比例分別為1.17%、6.22%、9.87%、2.09%。

3討論

該試驗(yàn)用的是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，其把液相色譜和質(zhì)譜連接起來，利用的是內(nèi)噴射式和粒子流式接口的技術(shù)。它的工作原理是通過電離等方式，破壞中性化合物分子，使其產(chǎn)生分子離子和碎片離子，這些離子按照質(zhì)量和電荷之比（m/z）的大小順序被記錄下，形成質(zhì)譜圖，從而實(shí)現(xiàn)對化合物的分析檢測。HPLC-MS/MS技術(shù)與其他技術(shù)相比，其質(zhì)譜系統(tǒng)有卓越的靈敏度能夠確保對超痕量的最低檢測，同時(shí)其還具有高性能和可靠性的特點(diǎn)。該試驗(yàn)采用HPLC-Ms/MS檢測方法，結(jié)果表明在口灌組及浸泡組，肝臟組織中的立達(dá)霉以原藥（M0）為主，高于75.00%；立達(dá)霉在草魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要有4種，分別為N-（2-羧基6-苯甲基）-N-（甲氧乙酰基）丙氨酸、N-[（2-羥甲基）6-甲苯基]-N-（羥乙?；┍彼?、N-（2，6二甲苯基）-N-（羥乙?；┍彼岷蚇-（2-羥甲基-6-苯甲基）-N-（甲氧乙?；┍彼峒柞?，各代謝產(chǎn)物所占的比例均小于10.00%。

因此，立達(dá)霉在草魚組織中殘留應(yīng)以立達(dá)霉原藥作為殘留檢測標(biāo)識物。