人工蟲草類產(chǎn)品質(zhì)量比較研究

劉旻虹 韋敏 徐霞 鄭生智 夏安扣

摘要 [目的]對比研究不同人工蟲草產(chǎn)品中有效物質(zhì)含量。[方法]依照 《中華人民共和國藥典》（2015版）中的方法體系測定了人工蟲草類產(chǎn)品的水分、灰分、浸出物含量；利用高碘酸鈉比色法測定蟲草酸；利用苯酚-硫酸法測定多糖；利用高效液相法測定腺苷、蟲草素含量；國標法測定了蛋白、IgG含量，同時以天然冬蟲夏草作為對照。[結(jié)果]不同人工蟲草中蟲草酸、蟲草素、腺苷及多糖，蛋白質(zhì)和IgG的含量均不同，其他蟲草是否能替代冬蟲夏草用于臨床用藥，還有待于進一步研究驗證。[結(jié)論]該研究可為開發(fā)利用蟲草的藥用價值提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 蟲草；質(zhì)量控制；替代應用

中圖分類號 R282文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）31-0170-03

Abstract [Objective]Comparative study on the content of effective substances of Cordyceps sinensis originated from different cultivars. [Method]Determination of moisture， ash and extract content according to the 2015 version of China Pharmacopoeia in the relevant provisions of the system；determination of the content of cordycepic acid by sodium periodate colorimetric method；determination of the content of polysaccharides by phenol sulfuric acid method；determination of the content of adenosine and cordycepin by HPLC；determination of the cordycepic acidontent of protein and IgG by national standard method. [Result]The contents of cordycepic acid， polysaccharide， adenosine and cordycepin， protein and IgG in different Cordyceps sinensis are different， and whether Cordyceps sinensis originated from other cultivars can replace Cordyceps sinensis for clinical use remains to be further studied and verified.[Conclusion]The study can provide theoretical basis for the development and utilization of medicinal value of Cordyceps sinensis.

Key words Cordyceps sinensis；Quality control；Alternative application

冬蟲夏草（cordyceps）為麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上及幼蟲尸體的復合體[1]，為我國傳統(tǒng)滋補中藥材。記載其功效為“補肺益腎，止血化痰”，可用于“久咳虛喘，勞嗽咯血，陽痿遺精，腰膝酸痛”。但由于其生長條件要求高，目前瀕于滅絕，被列為國家重點保護野生植物（Ⅱ級），2016年國家食品藥品監(jiān)督管理局印發(fā)通知停止冬蟲夏草用于保健食品試點工作（食藥監(jiān)食監(jiān)三〔2016〕21號）。冬蟲夏草的創(chuàng)造是一種復雜也是有偶然因素的形成過程，但并非不可取代。

蛹蟲草[Cordyceps militaris（Lex.Fr）Link]又名北冬蟲夏草，隸屬子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Cordycepps）蟲草屬[Cordyceps sinensis（Berkeik）saccardo sp.]。單純用培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草菌稱為蟲草花[2]；以蠶蛹作寄主寄生培育，稱為北蟲草或蛹蟲草；以家蠶幼蟲為寄主寄生培育，稱為蠶蟲草，其蟲草形態(tài)更接近天然蟲草[3]。目前蛹蟲草子實體，正式獲得國家衛(wèi)生部“新資源食品”批文[衛(wèi)食新準字（2006）第0001號]，這種新式藥材漸漸替換了冬蟲夏草，具有優(yōu)良前景。

目前市場有一定量人工蟲草產(chǎn)品的應用，但沒有規(guī)范的質(zhì)量控制方法。為了確保人工蟲草產(chǎn)品合理有效的應用，使其質(zhì)量評價有具體的量化指標，筆者按照《中華人民共和國藥典》（2015版）中的方法系統(tǒng)測定了人工蟲草產(chǎn)品的水分、灰分、浸出物含量，還進行了人工蟲草品質(zhì)相關(guān)指標的測定，特別首次測定了與蟲草免疫活力相關(guān)的IgG含量，力求提供替代合理性的評價依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。電子天平（ EL303），梅特勒-托力多儀器；KQ-2200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6050真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；紫外分光光度計；安捷倫1260 UPLC-DAD- 6530 ESI-QTOF MS。

1.1.2 主要試劑。

蟲草素（Cordycepin，貨號C3394）、D-甘露醇（M412），購自美國Sigma公司；腺苷（Adenosine，Amresco 0325），購自美國Amresco公司；五氧化二磷、無水氯化鈣、乙醇、高碘酸鈉、碘化鉀、硫代硫酸鈉、甲醇等試劑均為分析純；乙腈為色譜純。

1.1.3 供試樣品。

蟲草花：購買于市場。

蠶蟲草：由江蘇省中國科學院植物研究所自我培養(yǎng)，其菌種經(jīng)江蘇省中國科學院植物研究所呂曄研究員鑒定為北蟲草菌（Cordyceps militaris），冷凍干燥后備用。

蛹蟲草：由江蘇省中國科學院植物研究所自我培養(yǎng)，其菌種經(jīng)江蘇省中國科學院植物研究所呂曄研究員鑒定為北蟲草菌（Cordyceps militaris），冷凍干燥后備用。

冬蟲夏草分別購買自西藏自治區(qū)藥材公司、南京同仁堂藥店、南京大華中藥店。

1.2 方法

蟲草含有多種活性成分，其中腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草蛋白是蟲草類的主要活性物質(zhì)，含量豐富。

1.2.1 樣品的處理。

分別取蟲草花、蛹蟲草、蠶蟲草和冬蟲夏草，60 ℃烘干，粉碎，過80目篩，混合均勻。每個樣品平行制備3份。

1.2.2 水分、灰分、浸出物含量測定。

按 2015 年版《中國藥典》一部要求測定水分（附錄 IX H 水分測定法第三法）、總灰分（附錄 IX H 總灰分測定法）、水溶性浸出物（附錄 XA）。

1.2.3 多糖、蛋白含量測定。

參考GB 5009.5—2010 食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定中的第一法測定蟲草蛋白的含量；根據(jù)GB/T 5009.194—2003保健食品中免疫球蛋白IgG的測定方法檢測IgG含量；對不同人工蟲草測定結(jié)果進行比較。

苯酚-硫酸法測定蟲草多糖的含量[6]。

1.2.4 蟲草酸含量測定。

高碘酸鈉比色法測定甘露醇（蟲草酸）的含量[4]。

1.2.5 腺苷和蟲草素含量測定。

高效液相法測定蟲草素、腺苷 [5]，方法學考察如下，按照標準曲線計算不同人工蟲草中含量。

1.2.5.1 色譜條件。色譜柱：Knauer Europher–100 C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：乙腈–0.05 mol/L KH2PO4緩沖液（7.5∶92.5）；流速：1 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.5.2 檢測波長的選擇。精密量取腺苷、蟲草素對照品適量，加入甲醇制成含腺苷 0.1 mg/mL、蟲草素 0.2 mg/mL的溶液，紫外掃描后發(fā)現(xiàn)腺苷、蟲草素均在 259.3 nm 處有最大吸收，所以最終選擇波長 260 nm 測定腺苷和蟲草素。

1.2.5.3 對照品溶液的制備。精密量取于105 ℃干燥至恒重的腺苷、蟲草素對照品，放入容量瓶中，加甲醇定容至10 mL，搖勻。從中吸取 1 mL于 50 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，制成每 1 mL 含腺苷 23.2 μg、蟲草素 30.0 μg 的溶液，作為對照品溶液。

1.2.5.4 線性關(guān)系考察。上述色譜條件分別以對照品溶液 1、5、10、15、20 μL進樣量進行測定，以對照品溶液的進樣量（ng）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。

2 結(jié)果與分析

參照《中華人民共和國藥典》（2015版）規(guī)定的檢測內(nèi)容，對人工蟲草藥材的質(zhì)量標準進行了較為全面、系統(tǒng)的研究，不僅有常規(guī)的蟲草酸、蟲草素，還包括了腺苷、多糖、蛋白及IgG多項指標，特別是與免疫功能相關(guān)的IgG含量測定，為人工蟲草藥材的質(zhì)量評價提供了試驗基礎和理論依據(jù)，測定結(jié)果如表1所示。

2.1 不同蟲草產(chǎn)品中水分、灰分、浸出物的含量比較

如表1所示，一般市售的蟲草類產(chǎn)品水分在14%左右，筆者課題組研制的蠶蟲草、蛹蟲草由于采用冷凍干燥，保存較好，故水分含量低。

生藥中灰分其實是生藥中的不揮發(fā)性無機鹽。由表1數(shù)據(jù)可見，冬蟲夏草總灰分較高，在13%左右，而蛹蟲草、蟲草花總灰分差異不大，蠶蟲草總灰分最少。

蟲草中的生物活性成分是核苷、蟲草酸、蟲草多糖，均易溶于水，故以水為溶劑進行浸出物測定。由表1數(shù)據(jù)可見，蟲草花的水溶性浸出物較冬蟲夏草、蛹蟲草、蠶蟲草高很多，超過80%，而其他3個樣品在24%～40%。

2.2 不同蟲草產(chǎn)品中多糖、蛋白質(zhì)含量比較

有關(guān)研究表明，蛹蟲草含有蛋白質(zhì)、脂類、糖類、維生素及多種微量元素，18 種氨基酸齊全，而且含有蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和超氧化物歧化酶等生物活性物質(zhì)，并且含量十分豐富[7-8]。

蟲草多糖在蛹蟲草的不同部位含量差異較大，主要存在于菌絲體中，王奇[9]的研究表明，蟲草多糖含量最多的是大米培養(yǎng)基菌絲體，其后依次是深層發(fā)酵菌絲體、以大米為培養(yǎng)基的人工栽培蛹蟲草子實體、以蠶蛹為培養(yǎng)基質(zhì)的人工栽培蛹蟲草子實體，蟲草多糖含量最低的是野生蛹蟲草子實體。表1結(jié)果與文獻相符，蟲草花的多糖含量最高，原因可能是菌絲體中多糖含量較多，也有可能蟲草花產(chǎn)品中帶有部分培養(yǎng)基，此結(jié)果也可以間接驗證蟲草花中水溶性浸出物大部分為多糖類成分。蟲草花中多糖成分具體為何有待于進行多糖成分測定驗證。

石繼紅等[10]通過蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果表明，天然冬蟲夏草與冬蟲夏草菌絲體中水溶性蛋白質(zhì)含量分別占其干重的2.00%和7.24%。表1結(jié)果表明，蛹蟲草及蠶蟲草中蛋白質(zhì)含量高于蟲草花及冬蟲夏草，此結(jié)果與文獻不相吻合，可能文獻測定的是冬蟲夏草菌絲體，而非北蟲草菌絲體。

2.3 不同蟲草產(chǎn)品中免疫球蛋白IgG含量比較

免疫球蛋白（immunoglobulin）指具有抗體活性的動物蛋白，主要存在于血漿中。目前未見蟲草類成分中免疫球蛋白含量測定的報道。該試驗結(jié)果（表1）顯示，蠶蟲草含有的IgG是最高的。

2.4 不同蟲草產(chǎn)品中蟲草酸含量比較

蟲草酸又被稱為D-甘露醇，對抗自由基和機體免疫能力都有很好的提升效果，而且能補肺益腎、抑制病菌，因此其含量的檢測對蟲草質(zhì)量具有決定性意義。有關(guān)蟲草酸的研究證明，不同蟲草中蟲草酸所占的含量相似而蟲草花稍微高一點。江曉路等[11]檢測結(jié)果顯示，蛹蟲草深層發(fā)酵菌絲體含有比蛹蟲草和冬蟲夏草中都要高得多的蟲草酸成分。該結(jié)果顯示（表1），4種蟲草產(chǎn)品中蟲草酸含量無顯著性差異。

2.5 不同蟲草產(chǎn)品中腺苷和蟲草素含量比較

腺苷和蟲草素是蟲草中2種主要核苷類活性成分[12]，蟲草素能夠抑制 mRNA 的合成，是蟲草抗腫瘤活性成分。腺苷則是心腦系統(tǒng)活性成分，具有防止心率失常，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸活化酶活性等多重藥理作用。因此，對不同蟲草中腺苷和蟲草素的含量進行比較，具有重要的實際意義，特別其中腺苷含量目前是評價冬蟲夏草質(zhì)量優(yōu)劣的一個重要指標，《中華人民共和國藥典》2015年版冬蟲夏草項下明確規(guī)定其含量不能低于0.010%。

貢成良等[13]的檢測結(jié)果表明，人工培育家蠶蛹蟲草的化學成分與冬蟲夏草類似，且主要功效成分蟲草素高于冬蟲夏草。陸巍杰等[14]對北冬蟲夏草、冬蟲夏草及食用菌中核苷類功效成分進行比較，發(fā)現(xiàn)多糖和腺苷類物質(zhì)是大多數(shù)食用菌都具有的成分，而蟲草素是北冬蟲夏草、冬蟲夏草中所特有的物質(zhì)。表1結(jié)果表明，冬蟲夏草、蛹蟲草、蠶蟲草及蟲草花中都含有蟲草素，而且蠶蟲草中的含量最高，蛹蟲草次之；冬蟲夏草中蟲草素及腺苷含量都比較低，蛹蟲草及蟲草花中的腺苷含量是冬蟲夏草的十余倍。

3 討論

目前，由于冬蟲夏草資源日見匱乏[15]，而蛹蟲草作為冬蟲夏草的首選替代品逐漸受到國內(nèi)外專家的重視。同時人們研究發(fā)現(xiàn)，不同蟲草產(chǎn)品中蟲草酸、蟲草素、腺苷及多糖、蛋白質(zhì)和IgG的含量也不同。雖然人工培養(yǎng)的方法得到的不同蟲草產(chǎn)品中各活性有效成分都比天然的冬蟲夏草高，不同蟲草產(chǎn)品的成分研究對于解決冬蟲夏草價格昂貴、資源滅絕的問題提供了研究培養(yǎng)不同種蟲草的科學依據(jù)，但不同蟲草是否可以替代用于臨床用藥還有待于進一步研究驗證。

參考文獻

[1] 王林萍，余意，馮成強.冬蟲夏草活性成分及藥理作用研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（7）：132-136.

[2] 潘中華.蠶蟲草的培育研究[J].江蘇蠶業(yè)，200 23（4）：13-14.

[3] 顧寅鈺，張亞平，婁齊年，等.蠶蟲草研究現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（18）：154-155.

[4] 閆文娟，李泰輝，姜子德.比色法測定廣東蟲草蟲草酸含量[J].食用菌，2010（5）：73-74.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：115.

[6] 陳麗華，張清華，歐陽勝，等.蟲草發(fā)酵液多糖含量的測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（12）：2880-2882.

[7] 桂仲爭，朱雅紅.蛹蟲草的人工培育、有效成分及藥理作用研究進展[J].蠶業(yè)科學，2008，34（1）：178-184.

[8] 孫月，薛陽，王琦.野生蛹蟲草與組培蛹蟲草子實體的成分測定與分析[J].遼寧師專學報，1999，1（1）：86-87.

[9] 王奇.蛹蟲草功效成分研究進展[J].遼寧師專學報，201 13（3）：103-105.

[10] 石繼紅，黨化寧，萬一，等.冬蟲夏草菌絲體與天然冬蟲夏草蛋白成分的分析比較[J].藥物生物技術(shù)，2003，10（5）：304-307.

[11] 江曉路，孫月.蛹蟲草活性成分的測定[J].食用菌學報，1999，6（1）：47-50.

[12] 楊青，馮立，禇征，等.兩種加工方法獲得的北蟲草粉中有效成分比較[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（7）：1576-1577.

[13] 貢成良，吳友良，朱軍貞，等.家蠶蛹蟲草的人工培育及其成份分析[J].中國食用菌，1993，12（4）：21-23.

[14] 陸巍杰，唐永范，唐亮，等.北冬蟲夏草、冬蟲夏草及食用菌中核苷類功效成分的比較研究[J].中國科技產(chǎn)業(yè)，2012（9）：54-57.

[15] 王鋼力，金紅宇，韓小萍，等.冬蟲夏草藥材的質(zhì)量研究及存在問題[J].中草藥，2008，39（1）：115-118.