白及總酚閃式提取工藝研究及含量測定

彭焱 唐克華

摘要?[目的]優(yōu)化白及塊莖中總酚的閃式提取工藝，并比較不同樣地人工栽培白及新生莖總酚含量。[方法]在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化閃式提取條件，F(xiàn)olin-酚比色法測定總酚含量。[結(jié)果]白及總酚閃式提取最佳條件：料液比1∶40、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、提取電壓160 V、提取時間100 s;5個樣地的7份栽培白及新生莖，總酚含量最低的為0.10%，最高的為0.67%。[結(jié)論]閃式提取法能滿足白及總酚迅速提取的要求;不同栽培品種的白及新生莖總酚含量差異較大，這對于白及品質(zhì)評價具有一定的參考價值。

關(guān)鍵詞?白及;新生莖;總酚;閃式提取;含量測定

中圖分類號?S567.239;R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號?0517-6611（2018）33-0157-04

白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科白及屬多年生草本植物，以其干燥塊莖入藥，藥用歷史悠久，主要藥用于機體的肺、胃、肝等經(jīng)脈臟腑病癥，如吐血、咯血、外傷出血、燒燙傷、皮膚皸裂等[1]。白及鮮品色白，是傳統(tǒng)的美容藥材，藥效溫和且無不良反應(yīng)，常作為功能日化產(chǎn)品原料，如白及牙膏，用于咽喉紅腫熱痛、口腔潰爛、牙齦炎等口腔和牙科疾病的輔助治療[2]。白及目前在保健、美容日化等方面的應(yīng)用越來越廣泛[3]。研究表明，白及含有黏膠質(zhì)（白及多糖）、淀粉、聯(lián)芐類、菲類及其衍生物、花色素苷類、黃酮類、多酚類、氨基酸及少量的揮發(fā)油等生物活性物質(zhì)[4]，具有抗胃潰瘍、抗氧化、抗菌抗炎、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等[5-6]生理作用。植物酚類化合物主要分為類黃酮、酚酸和單寧三類。常見的植物酚酸有綠原酸（chlorogenic acid）、原兒茶酸（protocatechuic acid）、沒食子酸（gallic acid）和咖啡酸（caffeic acid）等，植物酚酸有較強的抗氧化、抗菌、抗腫瘤活性，被廣泛應(yīng)用于保健食品、化妝品等[7]。楊毅等[8]從白及塊莖中分離得到4種多酚類物質(zhì)，可見白及中含有多種多酚類物質(zhì)，如能作為新的植物多酚資源開發(fā)，這對白及的深加工有重要意義。植物中酚酸種類及含量受多因素影響，如植物成熟期、種植方式及加工條件等[9]。閃式提取器是根據(jù)組織破碎原理而設(shè)計的一種新型提取器，具有室溫提取、無成分破壞、操作簡單快速、高效節(jié)能等優(yōu)點[10]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物成分的提取。目前，關(guān)于白及總酚提取測定的研究報道還較少，筆者以白及干粉為原料，研究其總酚的閃式提取工藝，并對采自武陵山區(qū)5個樣地的7份栽培白及新生莖部位的總酚含量進(jìn)行了提取和測定。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?儀器。

閃式提取器（型號JHBE-20A，河南智晶生物科技發(fā)展有限公司）;高速多功能粉碎機（型號150T，永康市鉑歐五金制品有限公司）;電子分析天平（型號AL204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;紫外分光光度計（型號Evolution 220型，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;臺式低速離心機（型號TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠）;臺式高速冷凍離心機（型號TGL20M，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號HH-S4，江蘇金城國勝試驗儀器廠）;紅外水分快速測定儀（型號HB43-S，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（型號GZX-9146 MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.1.2?試劑。無水乙醇、95%乙醇（AR），天津市北辰方正試劑廠;甲醇（AR），天津市大茂化學(xué)試劑廠;鹽酸（AR），株洲市星空化玻有限責(zé)任公司;Folin酚（AR，C=1.00 mol/L），上海金穗生物科技有限公司;無水碳酸鈉（AR），天津市大茂化學(xué)試劑廠;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%），張家界久瑞生物科技有限公司。

1.1.3?試材。2017年10月，在武陵山區(qū)的湖南省洪江市、桑植縣、慈利縣、武陵源區(qū)和湖北省鶴峰縣等地，采集栽培3年的白及樣本共8份，每個樣地隨機采集長勢比較接近的帶土白及3株，樣本經(jīng)吉首大學(xué)唐克華教授鑒定為蘭科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]。收集樣株各自所帶泥土、干燥留樣備測，植株體用自來水沖洗、洗凈根莖附著的泥土，晾干表面水分后剪掉樣株的須根、包莖葉，將不同生長年限部位精確分離并稱量、分類標(biāo)記，再置于烘箱65 ℃下干燥以便長期貯存，干燥好的樣本使用高速多功能粉碎機粉碎并過30目篩，封裝標(biāo)記、保存?zhèn)溆?。各樣本的產(chǎn)地信息及干燥水分含量見表1。

1.2?試驗方法

1.2.1?總酚測定方法。采用Folin-酚比色法，參考文獻(xiàn)中的方法并略作修改[11]。精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，加無水乙醇定容至10 mL，得1.00 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃冰箱保存，臨用時先以無水乙醇稀釋10倍，然后再取稀釋樣液1.0 mL用蒸餾水稀釋8倍。取稀釋好的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 mL于10 mL容量瓶中，加入1.00 mol/L的Folin-酚0.5 mL，黑暗條件下放置10 min，再加入1.00 mol/L無水碳酸鈉溶液2.0 mL，充分混勻，50 ℃水浴處理10 min，冷卻至室溫，在770 nm處測定吸光度。以所測樣液中的沒食子酸質(zhì)量X（mg）為橫坐標(biāo)、樣液吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=28.606X+0.101 7（R2=0.999 1，線性范圍0.005 0～0.017 5 mg）。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品總酚含量。

1.2.2?單因素試驗。以乙醇-水溶液作為提取劑，準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎過30目篩的白及樣本（編號SZ）干粉3份。在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，以提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取電壓、料液比4個因素的水平值為研究對象。在提取料液比1∶30（g∶mL）、體積分?jǐn)?shù)35%乙醇、提取電壓50 V進(jìn)行閃式提取，分別提取30、60、90、120、150 s，考察提取時間對提取液中總酚得率的影響。在提取料液比1∶30、提取電壓50 V、提取時間30 s進(jìn)行閃式提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為35%、50%、65%、80%、95%，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取液中總酚得率的影響。在提取料液比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、提取時間30 s進(jìn)行閃式提取，提取電壓分別設(shè)定為50、80、110、140、170 V，考察提取電壓對提取液中總酚得率的影響。在提取電壓50 V、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、提取時間30 s進(jìn)行閃式提取，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70提取，考察提取料液比對提取液中總酚得率的影響。提取液均經(jīng)4 000 r/min離心5 min，取上清液按“1.2.1”中方法進(jìn)行檢測。

1.2.3?正交試驗設(shè)計。在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用SPSS 20.0軟件，設(shè)計4因素3水平的正交優(yōu)化試驗，以提取液中總酚得率為評價指標(biāo)，確定閃式提取白及中總酚的最佳條件。正交試驗因素與水平設(shè)計見表2。

1.2.4?白及總酚提取方法的比較研究。取經(jīng)粉碎過30目篩的白及樣本（編號SZ）干粉3份，分別在不同提取方式下進(jìn)行提取。其中，回流提取[12-13]為：料液比1∶45，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，提取時間1.5 h;閃式提取為：料液比1∶45，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，提取時間100 s;甲醇研磨提取[14]為：無水甲醇，料液比8∶1，研磨至勻漿，黑暗環(huán)境下靜置24 h，再經(jīng)12 000 r/min離心15 min，上清液儲存于4 ℃冰箱，備測。

2?結(jié)果與分析

2.1?單因素試驗

2.1.1?提取時間的影響。由圖1可知，在30～120 s，白及提取液中總酚得率隨提取時間延長而增加。提取時間大于120 s 之后，提取液總酚得率下降，推測這可能是提取時間加長導(dǎo)致提取液溫度升高，促使提取液中多酚類物質(zhì)氧化加快，從而導(dǎo)致總酚得率降低。

2.1.2?乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響。由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在35%～65%時，提取液總酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)65%以后，提取液的總酚得率開始逐漸降低。分析認(rèn)為，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高，一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強的成分溶出增加，這些物質(zhì)成分影響多酚類化合物從原料顆粒中的溶出，從而導(dǎo)致提取液總酚得率降低。

2.1.3?提取電壓的影響。由圖3可知，提取電壓在50～140 V時，提取液中總酚得率隨提取電壓升高而升高，當(dāng)提取電壓達(dá)140 V后，提取液的總酚得率出現(xiàn)降低趨勢。分析其原因為：電壓控制著閃式提取器的轉(zhuǎn)速，隨著提取電壓升高，提取器的攪拌轉(zhuǎn)速越大，提取液溫度急速上升促使多酚類物質(zhì)加快氧化，樣液中的多酚含量降低。

2.1.4?提取料液比的影響。由圖4可知，提取料液比在1∶30～1∶40時，提取液總酚得率隨著料液比的增大而快速升高，當(dāng)料液比大于1∶40之后，提取液中總酚得率逐漸降低。推測原因是：顆粒物料在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著提取料液比增大，液體傳質(zhì)推力呈相應(yīng)升高，可促進(jìn)顆粒物料中提取成分的擴(kuò)散、溶出，促進(jìn)成分提取率提高;當(dāng)物料濃度超出最適范圍后，液體傳質(zhì)推動力反而下降，阻礙了顆粒物料中成分的擴(kuò)散和溶出，提取率相應(yīng)地下降。

2.2?正交試驗

由表3中R值可知，因素B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對閃式提取的影響最大，各因素對總酚提取的影響順序為B>C>D>A。但方差分析顯示，提取時間對白及總酚閃式提取的影響不顯著，其他3個因素水平值對白及總酚閃式提取的影響顯著。因此，可得最佳提取因素的組合為B1C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、提取電壓160 V、提取料液比1∶40，提取時間原則上選取最短提取時間100 s，以減輕提取時間延長而增加提取的多酚類物質(zhì)暴露于空氣中被加速氧化的威脅。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎過30目篩的白及樣本（編號SZ）干粉3份，按照最佳提取組合條件進(jìn)行驗證性試驗，得到提取液總酚的平均含量為1.38%，與優(yōu)化試驗中含量最高提取組的很接近，說明優(yōu)化后的最佳提取組合條件穩(wěn)定性較高。

2.3?白及總酚提取方法的比較研究

將閃式提取法與文獻(xiàn)報道的2種白及總酚提取方法進(jìn)行比較研究，提取結(jié)束后分別測定提取液的白及總酚得率，結(jié)果如圖5。由圖5可知，3種方式提取白及總酚的效率不同，差異較大，以閃式提取法的提取率最高，研磨提取法的最低。閃式提取法的提取率較研磨提取法的提高了138.89%，較回流法提取的提高了57.32%。對于白及總酚提取而言，回流提取法溶劑消耗量大、耗時長，持續(xù)加熱能耗高，提取率不高;研磨提取法提取量小、提取率較低;閃式提取法提取時間短，而且能夠最大限度保護(hù)提取總酚的活性，操作簡便，提取效率高，安全、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)。

2.4?不同樣地栽培白及新生莖的總酚含量差異?按優(yōu)化獲得的最佳閃式提取組合條件，提取測定5個樣地的7份栽培白及樣本新生莖的總酚含量，結(jié)果如圖6。由圖6可知，5個樣地7份栽培白及樣本，其新生莖的總酚含量高低為MS>YS>NS>ZJ>HJ>HS>TR。其中，HS（湖北狹葉白及）、TR（湖南桑植引種自貴州銅仁白及）的新生莖總酚含量較低，其中TR最低，僅有0.10%;MS（湖北米氏白及）新生莖總酚含量最高，達(dá)0.67%。采用SPSS 20.0分析白及樣本總酚含量與樣地海拔（表1）相關(guān)性，得r=0.571、0.400<|r|<0.600，該結(jié)果反映樣本總酚含量與樣地海拔相關(guān)性不顯著。

3?結(jié)論

閃式提取器憑借其適用范圍廣，能適用于植物根、莖、葉、花等軟、硬材料的快速提取，目前在中藥材有效成分提取上的應(yīng)用十分廣泛。試驗中首次運用閃式提取法提取白及總酚，優(yōu)化得出的最佳提取工藝條件：提取時間100 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、提取電壓160 V、提取料液比1∶40，在此條件下白及提取液中總酚得率為1.38%。以該最佳提取組合條件提取測定比較了7份栽培白及樣本新生莖的總酚含量，其最低者為TR（湖南桑植引種自貴州銅仁白及），僅0.10%，最高者是MS（湖北米氏白及），達(dá)0.67%。經(jīng)初步分析表明，白及總酚含量與樣地海拔的相關(guān)性不顯著。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：95.

[2] 馬世宏，金玲，王守香，等.中藥白芨在牙膏中的應(yīng)用研究[J].中國野生植物資源，2009，28（3）：32-35.

[3] 馬世宏，金玲，揭邃，等.白芨-丹皮酚包合物在化妝品中的應(yīng)用研究[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2009，32（6）：30-33.

[4] 梁宇軒，何曉梅，朱富成，等.白及主要生物活性物質(zhì)及藥理作用研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018（3）：107-109.

[5] JIANG F S，LI W P，HUANG Y F，et al.Antioxidant，antityrosinase and antitumor activity comparison ： The potential utilization of fibrous root part of Bletilla striata （Thunb.） Reichb.f.[J].PLos One，2013，8（2）：1-11.

[6] SUN A J，LIU J Q，PANG S，et al.Two novel phenanthraquinones with anticancer activity isolated from Bletilla striata[J].Bioorg Med Chem Lett，2016，26（9）：2375-2379.

[7] 徐靜，商志偉，楊森，等.唇形科植物酚酸類化合物的生物活性與生產(chǎn)應(yīng)用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（8）：94-98.

[8] 楊毅，艾萍，楊麗萍，等.白及薄層色譜條件的改進(jìn)和主要色譜斑點化學(xué)成分的鑒定[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（9）：23-25.

[9] 徐貴華，關(guān)榮發(fā)，葉興乾，等.不同成熟期蜜桔中酚酸的組成與分布[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：137-141.

[10] 劉延澤.植物組織破碎提取法及閃式提取器的創(chuàng)制與實踐[J].中國天然藥物，2007，5（6）：401-407.

[11] 周云凱，李偉平，田莎莎，等.白及須根和塊莖總酚含量的測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（10）：161-164.

[12] 翁夏蒙，魯光耀，王鴦妮，等.白及愈傷組織總酚含量測定以及抗氧化活性研究[J].中藥材，2013，36（1）：32-35.

[13] 陳黎，楚亞琴，王啟斌，等.鄂西北地區(qū)白及中總酚含量的測定[J].中國藥師，2013，16（11）：1679-1682.

[14] 蔡英豪，龔寧，李德琴，等.白及原球莖褐變過程中總酚及相關(guān)酶活性的變化[J].北方園藝，2013（6）：97-99.