重組角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)的原核表達(dá)及優(yōu)化

田順立 鄭春陽

摘要?[目的]在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF）的表達(dá)及優(yōu)化。[方法]選取缺失N端23個(gè)氨基酸殘基的KGF片段作為目的基因，按照大腸桿菌的密碼子偏好性，將其進(jìn)行密碼子優(yōu)化。使用BL21（DE3）菌株表達(dá)KGF（ΔN23）、SUMO融合的SUMO-KGF（ΔN23）和Fh8-SUMO融合的Fh8-SUMO-KGF（ΔN23），并測試不同表達(dá)溫度（37、23 ℃）對KGF（ΔN23）表達(dá)結(jié)果的影響。[結(jié)果]在BL21（DE3）菌株中，37 ℃表達(dá)時(shí)KGF（ΔN23），SUMO-KGF（ΔN23）和Fh8-SUMO-KGF（ΔN23）的表達(dá)量都較高，其中可溶性蛋白表達(dá)量KGF（ΔN23）< SUMO-KGF（ΔN23）< Fh8-SUMO- KGF（ΔN23）。降低誘導(dǎo)溫度為23 ℃后，3種KGF的表達(dá)量都顯著降低，但是可溶性蛋白的占比顯著提高，均接近100%。[結(jié)論]降低誘導(dǎo)溫度能夠促進(jìn)KGF的可溶性表達(dá)，但是總蛋白的表達(dá)水平顯著下降;與可溶性標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)能夠提高KGF在37 ℃表達(dá)時(shí)可溶性蛋白占比，其中融合Fh8-SUMO標(biāo)簽的KGF表達(dá)量和可溶性蛋白占比較高。

關(guān)鍵詞?角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF）;原核表達(dá)系統(tǒng);密碼子優(yōu)化;融合表達(dá);標(biāo)簽蛋白

中圖分類號(hào)?Q813;Q816文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）33-0071-04

角質(zhì)細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）又稱為成纖維細(xì)胞生長因子-7（fibroblast growth factor-7，F(xiàn)GF-7），是FGFs超家族中角質(zhì)細(xì)胞生長因子家族中的一員。KGF最初是從人胚胎肺成纖維細(xì)胞系M426的培養(yǎng)上清中分離純化出來的，具有促進(jìn)小鼠角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的作用[1]。后來的研究發(fā)現(xiàn)，KGF是由各種來源的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)分泌的，其主要作用是促進(jìn)各種類型上皮細(xì)胞的增殖和分化，在受損上皮細(xì)胞的修復(fù)和各種組織器官的傷口愈合過程中發(fā)揮著重要作用[1-4]。

人類KGF的cDNA編碼產(chǎn)生具有分泌信號(hào)肽的194個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。從人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中分離的天然KGF，其表觀分子量為26～28 kD，而在大腸桿菌中重組表達(dá)的KGF，其表觀分子量約為21 kD，這與KGF N末端附近的N-和O-連接的糖基化修飾有關(guān)[5-7]。重組表達(dá)的KGF，雖然沒有經(jīng)過翻譯后修飾，但是仍具有生物活性，且其活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分離所得的天然KGF[5]。另外，有試驗(yàn)表明，刪除KGF信號(hào)肽序列下游的前23個(gè)氨基酸殘基，并不會(huì)改變KGF的活性，但是能夠顯著增加其穩(wěn)定性[5，8]。

雖然KGF能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生，但是這些來源的蛋白存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)性，且成本高、價(jià)格昂貴，導(dǎo)致KGF的藥物應(yīng)用受到很大的限制。相比之下，原核表達(dá)系統(tǒng)則具有一定的成本優(yōu)勢。但是，到目前為止，KGF在原核系統(tǒng)中的重組表達(dá)并未取得很好的成果，存在蛋白表達(dá)水平低、穩(wěn)定性差的問題[5，9]。為了實(shí)現(xiàn)KGF在原核系統(tǒng)中的規(guī)?；a(chǎn)，筆者擬在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組人源KGF的表達(dá)及優(yōu)化。

1?材料與方法

1.1?菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌克隆菌株DH5α購買自北京全式金生物技術(shù)有限公司，表達(dá)菌株BL21（DE3）購買自Promega公司，表達(dá)質(zhì)粒pET11a和pET28a均購自NEB公司，質(zhì)粒pET28a-SUMO由筆者所在實(shí)驗(yàn)室改造構(gòu)建。

1.2?KGF基因的合成

以人的角質(zhì)細(xì)胞生長因子基因（GenBank：HF548201.1）作為原始序列，參照大腸桿菌的密碼子偏好對基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.3?原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以合成的KGF基因?yàn)槟０澹ㄟ^PCR擴(kuò)增缺失信號(hào)肽下游N端23個(gè)氨基酸的KGF片段，所用引物為F1（5-TTTAAGAAGGAGATATACATGTCTTACGACTACATGGAAGGTGG-3）和R1（5-GCTTTGTTAGCAGCCGTCAGGTGATCGCCATCGG-3）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，通過重組克隆的方式連接到表達(dá)載體pET11a（經(jīng)NdeI/BamHI線性化），得KGF片段的表達(dá)載體pET11a-KGF（ΔN23）。

以上述質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增KGF片段，所用引物為F2（5-GTGAACAGATCGGTGGTTCTTACGACTACATGGAAGGTGG-3）和R2（5-GAATTCGGATCCATGGTCAGGTGATCGCCATCGG-3）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，通過重組克隆的方式連接到表達(dá)載體pET28a-SUMO（經(jīng)MscI線性化），得KGF片段的表達(dá)載體pET28a-SUMO-KGF（ΔN23）。

由金唯智公司合成編碼Fh8的基因（210 bp，Genebank：AF213970），通過PCR將其擴(kuò)增，所用引物為F3（5-GCCGCGCGGCAGCCATATGCCTAGTGTTCAAGAGG-3）和R3（5-AACTTCAGAGTCAGACATATGTGATGACAAAATCGAAAC-3）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，利用同源重組的方法連接到表達(dá)載體pET28a-SUMO-KGF（ΔN23）（經(jīng)NdeI線性化），得重組表達(dá)載體pET28a-Fh8-SUMO-KGF（ΔN23）。

1.4?目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測

將上述構(gòu)建好的表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）中。挑取單克隆至含有50 μg/mL卡那霉素或100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后，繼續(xù)37 ℃或23 ℃培養(yǎng)4 h，12 000 r/min離心2 min收集菌體。

用50 mmol/L Tris緩沖液（pH 8.0）將菌體重懸，超聲破碎后離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色后檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?角質(zhì)細(xì)胞生長因子KGF基因的優(yōu)化

為了提高角質(zhì)細(xì)胞生長因子KGF在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平，按照大腸桿菌的密碼子偏好性，將其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后基因序列如圖1所示。

2.2?KGF片段的原核表達(dá)

根據(jù)報(bào)道，切除了N端23個(gè)殘基的KGF蛋白穩(wěn)定性顯著提高，且活性不受影響[5，8]，所以筆者選取了缺失N端23個(gè)氨基酸殘基的KGF片段作為目的基因，進(jìn)行原核重組表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BL21（DE3）菌株中，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，不含任何標(biāo)簽的KGF（ΔN23）能夠表達(dá)，且表達(dá)量比較高，但是絕大部分蛋白以包涵體的形式存在，上清中的可溶性蛋白表達(dá)很少，不足10%（圖2）。降低誘導(dǎo)溫度為23 ℃后，KGF（ΔN23）幾乎完全在胞質(zhì)中可溶性表達(dá)，但是其總的表達(dá)量極少（圖2）。

2.3?KGF片段原核表達(dá)的優(yōu)化

為了提高KGF（ΔN23）的

可溶性表達(dá)，嘗試將其與可溶性的標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)?？紤]到標(biāo)簽以及標(biāo)簽切除后殘余殘基可能對KGF的活性和穩(wěn)定性造成一定影響，選擇能夠被ULP蛋白酶有效切除，且切除后無氨基酸殘基殘余的SUMO（small ubiquitinlike modifier）標(biāo)簽與其融合表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，與SUMO融合表達(dá)的KGF（ΔN23），在37 ℃誘導(dǎo)時(shí)，其表達(dá)水平顯著提高，且上清中的可溶性表達(dá)也有所增加，但是在沉淀中，以包涵體形式表達(dá)的KGF（ΔN23）仍然很多，占總蛋白的50%以上。降低溫度誘導(dǎo)時(shí)，KGF（ΔN23）幾乎完全在胞質(zhì)中可溶性表達(dá)，但是其總的表達(dá)量顯著降低。

Costa等[10]的研究表明，強(qiáng)酸性標(biāo)簽蛋白Fh8不僅分子量小（8 kD），而且能夠提高目的蛋白在原核系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)。為了進(jìn)一步增加KGF（ΔN23）在上清中的可溶性表達(dá)，在SUMO標(biāo)簽的N端增加了1個(gè)Fh8標(biāo)簽，這樣既不影響SUMO蛋白酶對標(biāo)簽的切割，又能增加融合蛋白的可溶性。結(jié)果如圖4所示，與Fh8-SUMO融合表達(dá)的KGF（ΔN23），在37 ℃誘導(dǎo)時(shí)，上清中的可溶性表達(dá)明顯增加，達(dá)到總蛋白的50%以上，且總蛋白的表達(dá)水平也有所提高。降低溫度誘導(dǎo)后，KGF（ΔN23）也幾乎完全在胞質(zhì)中可溶性表達(dá)，且其總的表達(dá)量也比較可觀，根據(jù)SDS-PAGE估算，搖瓶培養(yǎng)可產(chǎn)目的蛋白20～30 mg/L。

3?討論

隨著研究的逐漸深入，各種細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)及其調(diào)控機(jī)理的探明使人們認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞因子作為具有特定活性的調(diào)節(jié)蛋白，能夠參與調(diào)控人體的各種生理功能。近年來，細(xì)胞因子作為一種新型的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑在臨床應(yīng)用上取得了令人矚目的成就，同時(shí)，其在醫(yī)療美容行業(yè)的應(yīng)用價(jià)值也正在逐步突顯。

KGF作為纖維細(xì)胞生長因子超家族中的一員，能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和分化，對多種疾病，如肺水腫、消化道損傷、皮膚和角膜損傷都具有一定的治愈效果[11]。2004年，由美國Amgen公司開發(fā)的一種重組截短型的KGF（palifermin），已經(jīng)被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)作為藥物，用于降低血液惡性腫瘤患者在干細(xì)胞移植前接受高劑量輻射和化療過程中黏膜炎的發(fā)病率，減少損傷的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度[9]。目前，雖然KGF已經(jīng)在原核系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)[5，9]，但是由于KGF蛋白表達(dá)水平和穩(wěn)定性的限制，導(dǎo)致其生產(chǎn)水平降低，使藥物應(yīng)用受到很大的限制。

由于原核表達(dá)系統(tǒng)的低成本，該研究嘗試在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)KGF的重組表達(dá)及優(yōu)化。為了提高目的蛋白的穩(wěn)定性，選取了缺失N端23個(gè)氨基酸的KGF片段作為目的基因，進(jìn)行原核重組表達(dá)。通過密碼子優(yōu)化，可溶性標(biāo)簽融合表達(dá)，降低誘導(dǎo)溫度等優(yōu)化條件，來提高KGF在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平，并促進(jìn)其在上清中的可溶性表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低誘導(dǎo)溫度（如23 ℃）能夠促進(jìn)KGF的可溶性表達(dá)，但是總蛋白的表達(dá)水平顯著下降;與可溶性標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)不僅能促進(jìn)KGF在上清中的表達(dá)，而且不會(huì)影響蛋白的總體表達(dá)水平，且標(biāo)簽可嘗試在后期純化過程中切除。

綜上所述，在原核系統(tǒng)中進(jìn)行KGF重組蛋白的優(yōu)化表

達(dá)，仍然是一個(gè)成本低廉且快速有效的途徑。該途徑的深入研究與優(yōu)化，有望提高KGF重組蛋白的生產(chǎn)水平，對實(shí)現(xiàn)KGF在臨床與醫(yī)療美容行業(yè)的應(yīng)用具有重要意義。

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