棗皮紅色素提取及成分分析

劉紅霞 劉會 張慧亭 仝瑞建 許美秋 孔梁宇 鄭之明 趙旭升

摘要?[目的]以灰棗為原料，初步分析其提取、分離工藝及其活性成分。[方法]通過酸化乙醇提取法對棗皮紅色素進(jìn)行提取，采用單因素試驗考察不同pH對棗皮紅色素提取效果的影響。在此基礎(chǔ)上，利用pH梯度萃取法將棗皮紅色素粗提物依次經(jīng)過5% NaHCO3溶液、5% Na2CO3溶液、1% NaOH溶液進(jìn)行萃取，得到不同萃取組分。并采用顏色反應(yīng)和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對萃取物進(jìn)行初步分析。[結(jié)果]通過單因素試驗判定出pH=0.5的鹽酸乙醇溶液對棗皮紅色素提取效果最佳;堿液顏色反應(yīng)和鹽酸共沸顏色反應(yīng)結(jié)果顯示，棗皮紅色素可能為蒽醌類化合物和多酚類化合物;高效液相色譜法（HPLC）對不同萃取物組分進(jìn)行初步分析，得出棗皮紅色素存在于NaHCO3萃取組和Na2CO3萃取組，并且主要集中于NaHCO3萃取組分。[結(jié)論]該研究為棗皮紅色素的開發(fā)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?紅棗;棗皮;紅色素;pH梯度萃取;顏色反應(yīng);高效液相色譜

中圖分類號?TS202.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2018）33-0149-04

灰棗原產(chǎn)于河南新鄭等地，具有抗旱、耐瘠薄、抗病蟲，較抗風(fēng)和抗鹽堿，種植后豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等特點，適宜大面積發(fā)展?；覘椆麑崬殚L卵形，棗核較小，為中果型良種。干制的灰棗果肉致密，富有彈性，口味甘甜[1]，其主要營養(yǎng)成分包含VC、酚類、類黃酮、三萜酸、β胡蘿卜素和多糖等，具有滋陰補(bǔ)陽、歸脾胃經(jīng)、養(yǎng)血安神、緩和藥性的功能，此外還有抗癌、消炎、抗氧化、抗焦慮等功效[2-9]。

近年來合成色素違規(guī)使用而造成的食品安全事件屢見不鮮，大量的研究報告指出，幾乎所有的合成色素都不能向人體提供營養(yǎng)物質(zhì)，使用不當(dāng)甚至?xí)：θ梭w健康，導(dǎo)致生育力下降、畸胎等[10]。相較于大多數(shù)具有致癌風(fēng)險的合成色素，天然無污染的植物色素更受到人們的青睞，天然色素作為食品添加劑，具有安全性高、色澤鮮明的優(yōu)點，一些植物色素還具有一定的藥理功能，如常用色素中紅花黃色素具有抑制血栓形成、改善心肌供血、降血壓、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛等功效;姜黃色素具有降壓、利膽、行氣解郁、涼血破瘀等功效;類胡蘿卜素由于具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是VE的100倍，所以在食品行業(yè)中常用作食品抗氧化劑[11-12]。灰棗棗皮中含有大量紅色素（棗皮紅色素），具有穩(wěn)定性高、色澤純正、易溶于水、安全無毒并有一定的抗病毒、抗腫瘤等特點，是一種天然的色素資源，被稱為“活性維生素丸”[13-15]。

我國是棗果實產(chǎn)量較大的國家，市場上90%的大棗都來源我國，但棗加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展卻一直很遲緩，以粗產(chǎn)品居多，精深加工品較少[16]，因此棗皮紅色素的開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義[17-26]。筆者采用酸化乙醇法對棗皮紅色素進(jìn)行初步提取獲得粗提物，然后通過pH梯度萃取法對粗提物進(jìn)行進(jìn)一步分離，最后采用顏色反應(yīng)和高效液相色譜法對萃取物成分進(jìn)行初步分析，為棗皮紅色素的開發(fā)提供理論依據(jù)，不僅能將無用的棗皮變成可利用物質(zhì)，促進(jìn)資源的進(jìn)一步開發(fā)利用，又可以增加棗產(chǎn)品的額外產(chǎn)值。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

以灰棗為原料，采自學(xué)院棗種質(zhì)資源圃。甲醇、無水乙醇、乙醚、濃鹽酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉等，均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2?儀器

SYG-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器廠;FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;BPG-9070A精密鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HB10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，廣州儀科實驗技術(shù)有限公司;AP-9925N真空泵，天津市奧特賽恩斯儀器有限公司;超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;FE28型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;高效液相色譜儀，Germany。

1.3?試驗方法

1.3.1?干棗的制備。

挑選大小均一、色澤一致的新鮮灰棗，洗去表面灰塵并將其均勻鋪在托盤表面，置于烘箱中，關(guān)閉頂部通風(fēng)口。緩慢升溫至55 ℃保持4 h左右;待棗皮表面起皺時，將溫度升至65 ℃;在烘箱內(nèi)濕度達(dá)到70%時，打開頂部通風(fēng)口排氣15 min，待濕度降至55%左右時，再次關(guān)閉通風(fēng)口;排氣5～8次即可，將得到的干棗攤開降溫，密封保藏。

1.3.2?棗皮粉制備。

將干制的灰棗用清水沖洗2遍，冷水浸泡24 h，沸水浴5 min，立即放入冷水中進(jìn)行冷卻，挖去棗肉得到棗皮。將棗皮置于鼓風(fēng)干燥箱中，40 ℃烘干，一般15～20 h即可。最后采用粉碎機(jī)將烘干的棗皮進(jìn)行粉碎至粉末狀，過60目篩，貯存于陰涼干燥處備用。

1.3.3?酸化乙醇溶液提取棗皮紅色素工藝優(yōu)化。

以上述制備的棗皮粉為原料，選擇pH=0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0鹽酸乙醇溶液，料液比為1∶30，提取時間2 h、提取溫度80 ℃、浸提次數(shù)為3次的條件下分別進(jìn)行提取試驗，對比不同pH對棗皮紅色素提取的影響。

將不同pH條件下提取的棗皮紅色素3次浸提液分別進(jìn)行合并，浸提液經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮制得浸膏，浸膏經(jīng)真空干燥器進(jìn)行干燥即得棗皮紅色素粗制品，通過對不同pH下提取的浸膏顏色以及質(zhì)量分析，判定出最佳提取工藝。

1.3.4?棗皮紅色素粗提物的分離。

pH梯度萃取法是利用天然色素呈現(xiàn)的酸性不同，用不同堿度的水溶液進(jìn)行萃取，從而可以達(dá)到分離提取的目的。工藝流程如圖1所示。將上述棗皮粗制品依次通過5%NaHCO3溶液、5%Na2CO3溶液、1%NaOH溶液進(jìn)行萃取，獲得不同組分萃取液，將各萃取液經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮制得浸膏，并分別收集在3個干凈的培養(yǎng)皿，即得NaHCO3組浸膏、Na2CO3組浸膏、NaOH組浸膏。

1.3.5?棗皮紅色素的顏色反應(yīng)。

1.3.5.1?堿液反應(yīng)。堿液顏色反應(yīng)原理是若物質(zhì)為蒽醌類化合物，則堿水層呈現(xiàn)紅色或紫色。乙醚層由黃色變?yōu)闊o色。將萃取后得到的3種組分（NaHCO3組分、Na2CO3組分、NaOH組分）分別以1∶5的比例溶解，各移取1 mL分別置于3個離心管中，再向每管中各加2 mL乙醚，將乙醚層分別取出置于3個空離心管中，最后向各個不同組分剩余的水層和醚層分別加1 mL 5%NaOH溶液，觀察現(xiàn)象。

1.3.5.2?鹽酸共沸試驗。

將萃取后得到的3種組分（NaHCO3組分、Na2CO3組分、NaOH組分）分別以1∶5的比例溶解，用1 mL移液器分別吸取2 mL至試管中，再向各試管中加入1 mL濃鹽酸，沸水浴15 min，觀察顏色變化。

1.3.6?棗皮紅色素的高效液相色譜法分析。

1.3.6.1?樣品制備。將各組分浸膏分別用蒸餾水稀釋成500 μg/mL。再用一次性注射器各吸取1 mL，通過細(xì)菌過濾器直接過濾到進(jìn)樣品中，并做好標(biāo)記。

1.3.6.2?液相條件。色譜儀：Agilent Technologies 1290 Infinity Ⅱ;色譜柱：Eclipse×DB-C18、孔徑5 μm、大小4.6 mm×250 mm;流動相：乙腈;進(jìn)樣量20 μL;檢測波長340 nm;流速0.5 mL/min;柱溫25 ℃。

2?結(jié)果與分析

2.1?酸化乙醇溶液提取棗皮紅色素最佳工藝

選擇pH=0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0鹽酸乙醇溶液，料液比為1∶30、提取時間2 h、提取溫度80 ℃、浸提次數(shù)為3次的條件下分別進(jìn)行提取試驗，考察不同pH對棗皮紅色素提取效果的影響（與方法重復(fù)）。通過對提取物的顏色變化進(jìn)行觀察，試驗結(jié)果見圖2，由圖2可知，隨著pH的不斷增大，提取物浸膏顏色越來越淺，由酒紅色變?yōu)槌燃t色到淺黃色。通過計算提取物浸膏的得率，試驗結(jié)果如表1，可知pH=0.5時提取物得率最高，達(dá)22%。

2.2?棗皮紅色素的顏色反應(yīng)

2.2.1?堿液反應(yīng)。

將萃取后得到的3種組分（NaHCO3組分、Na2CO3組分、NaOH組分）分別進(jìn)行堿液反應(yīng)試驗，試驗結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，NaHCO3組分堿水層由無色變?yōu)榘导t色，醚層由淺黃色變?yōu)闊o色。Na2CO3組分水層由無色變?yōu)辄S色，醚層由黃色變?yōu)闊o色，NaOH組分無顏色變化。此現(xiàn)象說明，通過pH梯度萃取法對棗皮紅色素粗提物進(jìn)行分離，所得萃取物含有蒽醌類化合物，且存在于NaHCO3組分和Na2CO3組分，NaOH組分不含有蒽醌類化合物，主要集中在NaHCO3組分。

2.2.2?鹽酸共沸試驗。

將萃取后得到的3種組分（NaHCO3組分、Na2CO3組分、NaOH組分）分別與濃鹽酸混合，沸水浴15 min，試驗結(jié)果如圖4，觀察可得NaHCO3組分出現(xiàn)磚紅色沉淀，Na2CO3組分、NaOH組分不明顯。由此得出，NaHCO3組分中含有多酚類物質(zhì)，而Na2CO3組分、NaOH組分不含有此類物質(zhì)。

2.3?棗皮紅色素的高效液相色譜法分析

由上述堿液反應(yīng)和鹽酸共沸試驗可以得出，棗皮紅色素主要存在于NaHCO3組分和Na2CO3組分，因此，采用高效液相色譜法（HPLC）只對NaHCO3組分和Na2CO3組分進(jìn)行初步分析，試驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，NaHCO3組分出現(xiàn)3個峰，保留時間分別為4.585、4.782、5.124 min;Na2CO3組分出現(xiàn)2個峰，保留時間分別為4.666、4.764 min。表明NaHCO3組分和Na2CO3組分含同一種物質(zhì)，但NaHCO3組分與Na2CO3組分相比，多含一種物質(zhì)，其保留時間為5.124 min。

通過積分計算可得（表2），在保留時間為4.585、4.782、5.124 min的NaHCO3組分，相對應(yīng)的峰面積分別為503.30、932.44、191.12;在保留時間為4.666、4.764 min時，Na2CO3組分所含物質(zhì)的峰面積分別為105.53、344.14，說明在相同保留時間內(nèi)，NaHCO3組分的峰面積均高于Na2CO3組分的面積。由此表明，有效物質(zhì)主要存在于NaHCO3組分。同時此結(jié)果驗證了上述堿液反應(yīng)、鹽酸共沸試驗結(jié)果，并且驗證出pH梯度萃取法分離棗皮紅色素具有可行性。

3?討論與結(jié)論

棗皮為紅棗加工過程中產(chǎn)生的主要廢棄物之一，棗產(chǎn)品的加工生產(chǎn)過程中，棗皮常被當(dāng)成垃圾處理，造成環(huán)境污染，因其價格低廉，具有安全、無毒副作用、色澤明亮、性質(zhì)穩(wěn)定等特點，符合人們的消費理念，是一種良好的天然色素。該研究對棗皮紅色素提取、分離工藝以及物質(zhì)展開初步分析。通過單因素試驗，對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，pH=0.5的鹽酸乙醇溶液提取棗皮紅色素提取效果最佳，棗皮紅色素粗提物得率為22%;采用pH梯度萃取法對棗皮紅色素粗提物進(jìn)行分離，得到3種萃取物組分，分別為NaHCO3萃取物組分、Na2CO3萃取物組分、NaOH萃取物組分;通過顏色反應(yīng)（堿液反應(yīng)和鹽酸共沸試驗）對其物質(zhì)進(jìn)行初步分析，試驗結(jié)果表明，有效物質(zhì)為蒽醌類和多酚類化合物，其中蒽醌類化合物存在于NaHCO3萃取物組分和Na2CO3萃取物組分，且主要集中在NaHCO3萃取物組分，多酚類化合物存在于NaHCO3萃取物組分;最后采用HPLC對其萃取物組分進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，NaHCO3萃取物組分和Na2CO3萃取物組分含有相同的2種物質(zhì)，且在NaHCO3萃取物組分中的含量均高于Na2CO3萃取物組分中的含量，除此以外，NaHCO3萃取物組分含有1種物質(zhì)，其不存在于Na2CO3萃取物組分。此結(jié)果印證了上述顏色反應(yīng)的結(jié)果，同時證明pH梯度萃取法對棗皮紅色素粗提物進(jìn)行分離具有可行性，且有較好的分離效果。

目前國內(nèi)外對棗皮紅色素的研究主要集中在提取工藝及理化性能研究，對其成分與結(jié)構(gòu)分析相關(guān)報道相對較少，因此，對其成分與結(jié)構(gòu)分析是一項急需解決的問題。另外，與其他天然色素相比，關(guān)于棗皮紅色素的研究起步較晚，目前還處于初步階段。該研究通過pH梯度萃取法對棗皮紅色素粗提物進(jìn)行初步分離純化，為進(jìn)一步研究棗皮紅色素成分與結(jié)構(gòu)提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 周琳.河南省棗優(yōu)良品種介紹[J].山西果樹，2001（3）：28-29.

[2] 中國醫(yī)學(xué)院藥物研究所.中藥志：第三冊[M].北京：人民衛(wèi)生山版社，1993：135-136.

[3] GAO Q H，WU C S，WANG M.The jujube（Ziziphus jujuba Mill.）fruit：A review of current knowledge of fruit composition and health benefits[J].Journal of agricultural & food chemistry，2013，61（14）：3351-3363.

[4] EBRAHIMI S，MOLLAEI H，HOSHYAR R.Ziziphus jujube：A review study of its anticancer effects in various tumor models invitro and invivo[J].Cellular and molecular biology，2017，63（10）：122-127.

[5] LI J W，F(xiàn)AN L P，DING S D，et al.Nutritional composition of five cultivars of chinese jujube[J].Food chemistry，2007，103（2）：454-460.

[6] 李雪華，龍盛京.大棗多糖的提取與抗活性氧研究[J].廣西科學(xué)，2000，7（1）：54-56，63.

[7] LIU M J，ZHAO J，CAI Q L，et al.The complex jujube genome provides insights into fruit tree biology[J].Nature communications，2014，5：1-14.

[8] WOJDYO A，CARBONELLBARRACHINAA，LEGUA P，et al.Phenolic composition，ascorbic acid content，and antioxidant capacity of Spanish jujube（Ziziphus jujube Mill.）fruits[J].Food chemistry，2016，201：307-314.

[9] WAN C R，HAN D D，XU J Q，et al.Jujuboside A attenuates norepinephrine-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes by modulating MAPK and AKT signaling pathways[J].Molecular medicine reports，2017，17（1）：1132-1140.

[10] 葛宇.食品中人工合成色素使用法規(guī)及檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展[J].質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化，2011（9）：31-35.

[11] ABDELHAFIDH K，MHADHBI L，MEZNI A，et al.Protective effect of Zizyphus lotus jujube fruits against cypermethrininduced oxidative stress and neurotoxicity in mice[J].Biomarkers，2018，23（2）：167-173.

[12] 吳宇寬.紅棗紅色素的提取純化及其性質(zhì)和應(yīng)用研究[D].武漢：武漢工業(yè)學(xué)院，2008.

[13] 夏明，杜琪珍.天然紅色素研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2002，23（6）：38-41.

[14] 徐清海，明霞.天然色素的提取及其生理功能[J].應(yīng)用化工，2005，34（5）：268-270.

[15] 游鳳，黃立新，張彩虹，等.紅棗紅色素的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑，2012（4）：223-230.

[16] 邵佩蘭，徐明.正交試驗優(yōu)化紅棗色素提取工藝[J].食品科技，2014，39（3）：232-235.

[17] 陳韶華.超聲波法提取小口大棗棗皮紅色素及其穩(wěn)定性研究[J].食品科技，2011，36（10）：203-207.

[18] WANG D Y，ZHAO Y，JIAO Y D，et al.Antioxidative and hepatoprotective effects of the polysaccharides from Zizyphus jujube cv.Shaanbeitanzao[J].Carbohydrate polymers，2012，88（4）：1453-1459.

[19] 游鳳.紅棗果皮功能成分提取、分離與純化工藝的研究[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2014.

[20] 樊君，呂磊，尚紅偉.大棗的研究與開發(fā)進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2003，24（4）：161-163.

[21] 戴富才，趙娣，孫傲.大孔樹脂對棗皮紅色素的分離純化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（35）：17298-17300.

[22] 李勇.大棗棗皮紅色素的分離、生物活性及穩(wěn)定性的研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2013.

[23] 薛自萍，曹建康，姜微波.棗果皮中酚類物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009，25（S1）：153-158.

[24] 王桐，石麗花，陳惠.棗皮中食用色素的提取工藝及其穩(wěn)定性研究[J].中國食品添加劑，2006（5）：72-76.

[25] 鄒玉紅，郭琳，寇小燕.棗皮紅色素提取工藝的優(yōu)化及穩(wěn)定性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（25）：12659-12661，12675.

[26] GUO C J，YANG J J，WEI J Y，et al.Antioxidant activities of peel，pulp and seed fractions of common fruits as determined by FRAP assay[J].Nutrition research，2003，23（12）：1719-1726.