1例種鵝大腸桿菌病病原的分離與鑒定

劉明生 甘輝群 袁橙 郝福星 康金龍 周國棟

摘要 從江蘇興化市某種鵝場有疑似大腸桿菌病的病死鵝中，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗、血清型鑒定，分離鑒定出鵝大腸桿菌，其血清型為O11；通過動物致病性試驗，該菌株致病性中等毒力；藥敏試驗結(jié)果表明，所分離的大腸桿菌對氟甲喹、硫酸粘菌素、慶大霉素、阿米卡星高度敏感，這為臨床防治鵝大腸桿菌病提供實驗依據(jù)，并為制備鵝大腸桿菌自家苗奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 種鵝；大腸桿菌；分離鑒定；血清型；藥敏試驗

中圖分類號 S858.33文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）31-0069-02

Abstract The Escherichia coli was isolated and identified from a goose farm in Xinghua City， Jiangsu Province， by bacteria isolation and culture， morphological observation， biochemical test， serotype identification， and the serotype of E.coli was O11.The pathogenicity of the strain was moderately virulent by animal pathogenicity test.The results of drug sensitivity test showed that the isolated E.coli was highly sensitive to flumequine， colistin sulphate， gentamicin and amikacin， which provided the experimental basis for clinical prevention and treatment of goose E.coli and laid a foundation for the preparation of goose E.coli vaccine.

Key words Breeding geese；Escherichia coli；Separation and identification；Serotype；Drug sensitive test

鵝大腸桿菌病為危害養(yǎng)鵝業(yè)的主要傳染病之一，是由致病性埃希大腸桿菌所引起的，臨床表現(xiàn)為心包炎、肝周炎、氣囊炎、關(guān)節(jié)炎以及腦炎等，成年種鵝感染本病，可引起輸卵管炎、卵黃性腹膜炎，俗稱“蛋子瘟”，導(dǎo)致種鵝繁殖機能降低，甚至引發(fā)死亡，給種鵝養(yǎng)殖戶帶來較大的經(jīng)濟損失。筆者在社會服務(wù)過程中，多次遇到本病，現(xiàn)介紹一例種鵝大腸桿菌病病原的分離與鑒定過程，為鵝大腸桿菌病防治提供參考。

1 材料

1.1 病例介紹

2018年3月，位于江蘇省興化市的某一種鵝養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的約2000只種鵝反復(fù)發(fā)病。據(jù)主訴，種鵝2～3歲，排稀軟的水樣糞便，逐漸消瘦，最后死亡；產(chǎn)蛋率下降，蛋的質(zhì)量也下降，蛋殼粗糙，產(chǎn)軟殼蛋，受精蛋率降低，出雛率降低；發(fā)病期間先后投喂過氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素等抗菌藥物，投藥期間癥狀有所改善，但不能完全控制，仍有零星發(fā)病和死亡，造成很大的經(jīng)濟損失。

臨床檢查，發(fā)病母鵝表現(xiàn)精神差，羽毛亂，縮頭閉眼，產(chǎn)蛋下降，產(chǎn)薄殼蛋、軟殼蛋；食欲不振或者廢絕，腹部膨大，且明顯下垂甚至著地，運動緩慢，嚴(yán)重時如同企鵝姿勢。多數(shù)病鵝排白色或黃白色稀便，肛門周圍有糞便污染，脫水明顯。發(fā)病公鵝癥狀主要表現(xiàn)在外生殖器上，如陰莖潮紅、腫脹，嚴(yán)重者有壞死、潰瘍和結(jié)節(jié)，影響交配。

病理變化，先后挑取病死鵝4只進(jìn)行解剖，見病鵝消瘦，腹部膨大；切開腹部，可見腹腔內(nèi)積聚大量淡黃色、渾濁的體液，混有破碎的卵黃。肝臟腫大，表面有淡黃色凝固的纖維素性滲出物覆蓋，掀去覆蓋物，見肝表面有針尖大出血點及灰黃色壞死點。腸系膜充血、出血，有的發(fā)生粘連。卵巢變形萎縮，呈灰色、褐色等。輸卵管內(nèi)見淡黃色或黃白色的纖維素性分泌物。

1.2 主要試劑

培養(yǎng)基：葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、硫化氫、檸檬酸鹽、尿素、靛基質(zhì)、 M.R、V-P等生化發(fā)酵培養(yǎng)基， 以及麥康凱培養(yǎng)基粉、普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基粉、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉，均購自青島日水生物技術(shù)有限公司。

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗O血清及陰性血清：購自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司。

藥敏紙片：氟甲喹、慶大霉素、阿米卡星、多西環(huán)素、阿莫西林、新霉素、大觀霉素、恩諾沙星、硫酸粘菌素、頭孢噻呋、磺胺氯噠嗪、氟苯尼考等藥敏紙片，根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]，按要求自己制備。

1.3 試驗動物

由興化市宇鵬鵝業(yè)養(yǎng)殖有限公司提供10日齡健康雛鵝20只，按正常免疫程序免疫，即雛鵝1日齡、7日齡分別皮下注射小鵝瘟抗血清0.5 mL，不使用任何抗菌藥物。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌取病死鵝的肝、脾、卵黃、輸卵管分泌物等，分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上，置37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落特征。然后，選取在麥康凱瓊脂平板上生長良好的粉紅色或紅色菌落，繼續(xù)接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，置37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行純培養(yǎng)，備用。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 對分離的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

2.3 生化鑒定 按文獻(xiàn)[2]介紹方法，取純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)生化試驗。

2.4 血清型鑒定 參考文獻(xiàn)[3]，制備大腸桿菌O抗原，并對分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。

2.4.1 菌株O抗原的制備：用0.5%石炭酸生理鹽水適量，將上述營養(yǎng)瓊脂斜面上的純培養(yǎng)物洗下，制成濃稠菌懸液，細(xì)菌濃度約 1×1010個/mL，集于小瓶中，于高壓滅菌器中作用2 h，以破壞其K、H 抗原，制成O抗原，保存于4 ℃冰箱。

2.4.2 菌株 O抗原的鑒定：先用玻板凝集試驗，初步篩選可能的O血清型，然后通過試管凝集反應(yīng)對O 血清型進(jìn)行鑒定，定型標(biāo)準(zhǔn)為血清試管凝集價不低于1∶640。

2.5 致病性試驗

另用生理鹽水將營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔洗下，以平板計數(shù)法計算活菌數(shù)，再用生理鹽水調(diào)整細(xì)菌數(shù)，使?jié)舛燃s為1×109 個/mL。將20只10日齡雛鵝隨機分成2組，每組10只，第1組為試驗組，每只皮下注射菌懸液0.5 mL，第2組為對照組，每只皮下注射生理鹽水0.5 mL。注射后繼續(xù)飼養(yǎng)，48 h內(nèi)觀察臨床癥狀，并記錄死亡數(shù)。之后，無菌操作取病死鵝的心血、肝劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，并對分離出的菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2.6 藥敏試驗

選取12種藥敏紙片，氟甲喹、硫酸粘菌素、慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、磺胺氯噠嗪、多西環(huán)素、阿莫西林、新霉素、大觀霉素、頭孢噻呋、恩諾沙星，按K-B紙片擴散法[1]進(jìn)行藥敏試驗。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于15.1 mm為高度敏感，直徑在10.1～15 mm為中度敏感，小于10 mm為低度敏感或耐藥。

3 試驗結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離 病料在普通瓊脂培養(yǎng)基上長出圓形、灰白色、光滑、濕潤、邊緣整齊的直徑1～2 mm的不透明菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出中等大小圓形、粉紅色、表面光滑，濕潤的菌落。

形態(tài)學(xué)觀察，所分離的細(xì)菌為單個或成叢的革蘭氏陰性短小桿菌，菌體兩端鈍圓，與大腸桿菌的形態(tài)特征相符。

3.2 生化鑒定

所分離的菌株可發(fā)酵麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇，均可產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)菌株不利于蔗糖，少數(shù)菌株緩慢發(fā)酵。枸櫞酸鹽試驗和V-P 試驗結(jié)果均為陰性，M.R.試驗和吲哚試驗均為陽性。

3.3 血清型鑒定結(jié)果 經(jīng)過多因子和單因子鑒定，本次從該鵝場分離的菌株經(jīng)血清型鑒定為O11。

3.4 致病性試驗結(jié)果 試驗組于48h內(nèi)出現(xiàn)排稀糞癥狀，精神稍差，采食減少，48 h僅死亡2只，死亡鵝剖檢具有典型的鵝大腸桿菌病變特征，其余鵝只剖檢見氣囊渾濁或無病變；而對照組無臨床癥狀，全部存活。將試驗組2只病死鵝解剖，無菌采集心臟或肝臟，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h ，結(jié)果在麥康凱瓊脂平板上生長為粉紅色圓形菌落。

3.5 藥敏試驗結(jié)果 對該養(yǎng)殖場分離鑒定的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果見表1所示。從表1可以看出，從該養(yǎng)殖場分離鑒定的大腸桿菌對氟甲喹、硫酸粘菌素、慶大霉素、阿米卡星高度敏感，抑菌圈直徑>15 mm；對氟苯尼考、磺胺氯噠嗪、多西環(huán)素中度敏感，抑菌圈直徑為12～13 mm；對阿莫西林、新霉素、大觀霉素、頭孢噻呋、恩諾沙星低度敏感或耐藥，抑菌圈直徑<10 mm。

4 小結(jié)與討論

4.1 大腸桿菌鑒定

對該種鵝場的發(fā)病，通過病史調(diào)查、臨床癥狀、病理變化，初步診斷為大腸桿菌病；細(xì)菌培養(yǎng)特征、形態(tài)特征、生化特性及血清學(xué)結(jié)果表明，所分離的菌株為大腸桿菌，其血清型為O11；小鵝的致病性試驗結(jié)果表明，已鑒定的大腸桿菌血清型O1 其致病力中等，但對種鵝卻引起了排稀糞，產(chǎn)蛋下降，種蛋孵化率低下等癥狀，造成養(yǎng)殖戶重大經(jīng)濟損失。本實驗血清型的鑒定，也為下一步制備大腸桿菌自家苗防治本病奠定了基礎(chǔ)。

4.2 藥物敏感試驗 我們對該養(yǎng)殖場分離的菌株用臨床常用的12 種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明，本次分離菌株對氟甲喹、硫酸粘菌素、慶大霉素、阿米卡星高度敏感，而對氟苯尼考、多西環(huán)素、阿莫西林、頭孢噻呋等抗菌藥物的敏感性降低，這可能跟該養(yǎng)殖場的用藥習(xí)慣有關(guān)。據(jù)了解，該養(yǎng)殖場未曾使用過氟甲喹、硫酸粘菌素、慶大霉素、阿米卡星，而氟苯尼考、阿莫西林、頭孢噻呋等卻頻繁使用，這與宦海霞[4]、植嬋萍[5]等報道的基本一致。

4.3 鵝大腸桿菌病防治

第一，要加強生物安全管理，對鵝舍和場地進(jìn)行定期噴灑消毒，種蛋進(jìn)行浸泡或熏蒸消毒；必須嚴(yán)格控制進(jìn)出飼養(yǎng)場的人員、車輛、設(shè)備、用具等流動，定期滅蚊，滅蠅、滅鼠；要減少配種傳播，公鵝在配種前應(yīng)逐只檢查，凡外生殖器有潮紅、腫脹、壞死、潰瘍等病變的一律淘汰，不能留著種用[6-7]。

第二，對本病的治療，選用高敏藥物治療，如10%氟甲喹可溶性粉500 g，對水2 000 kg，全天集中1次飲服，連用4 d。隨后可改用中草藥制劑，如黃芩解毒散300 g，拌料1 000 kg，再連用4 d，取得了很好的治療效果。

第三，對本病的預(yù)防，除了加強飼養(yǎng)管理外，有條件的最好做自家滅活苗，對鵝群進(jìn)行免疫接種，能有效保護鵝群健康，降低致病性大腸桿菌的傳播。之后定期用微生態(tài)制劑或黃芩解毒散等中草藥添加劑拌料，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，維護腸道健康。

參考文獻(xiàn)

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[4] 宦海霞，苗曉青，周瓊，等.江蘇省部分地區(qū)鵝源致病性大腸桿菌的分離、鑒定和耐藥性分析[J].飼料工業(yè)，2007，28（15）：62-64.

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