高效液相色譜法測定茶鮮葉中18種游離氨基酸含量初探

董尚文 劉騰飛 董明輝

摘 要 建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測器測定茶鮮葉中18種游離氨基酸含量的方法。將茶鮮葉樣品攪碎混勻，以超純水作為萃取溶劑，在90 ℃水浴下浸提20 min，以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為衍生劑柱前衍生化，使用Symmetry C18色譜柱梯度洗脫。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限，18種氨基酸的檢出限為0.05～1.27 μmol·L-1。應(yīng)用該方法檢測了2個(gè)碧螺春茶鮮葉中18種氨基酸含量。結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確、快速、可靠。

關(guān)鍵詞 茶鮮葉；游離氨基酸；柱前衍生化；高效液相色譜

中圖分類號：TS272 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.11.071

茶是世界三大天然飲料之一，具有獨(dú)特的香氣、豐富的營養(yǎng)和保健功效[1-2]，深受消費(fèi)者喜愛。茶葉中氨基酸的分析方法有很多，中國發(fā)明專利“利用反相高效液相色譜檢測茶葉中游離氨基酸的方法”（專利號ZL201510109474.4）以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑，使用氨基酸專用分析柱進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合反相高效液相色譜，實(shí)現(xiàn)了對茶葉中谷氨酰胺等19種氨基酸的定量分析。

本研究以茶葉鮮樣代替茶葉干樣作為樣品，選用普通的Symmetry C18柱代替氨基酸分離專用柱，采用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑[3]，利用高效液相色譜-熒光檢測器分離分析，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)測定茶葉鮮樣中18種游離氨基酸的目的，為開展茶葉質(zhì)量評價(jià)、等級評定、指紋圖譜構(gòu)建提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀，配2475熒光檢測器；TG16-WS臺式高速離心機(jī)；K600粉碎機(jī)；LE-3000電熱恒溫水浴鍋；Direct-Q 5 UV超純水機(jī)。

1.1.2 藥品與試劑

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品，衍生試劑為6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯；乙腈為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.3 供試樣品

茶葉鮮樣取自蘇州洞庭東山和西山碧螺春茶園。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，得氨基酸單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中茶氨酸濃度為12.5 μmol·L-1，于-20 ℃冰箱保存。

取17種氨基酸混合標(biāo)液40 μL，加入40 μL 12.5 μmol·L-1茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容到1 mL，得到含茶氨酸的氨基酸混合標(biāo)液，其中茶氨酸濃度為

500 μmol·L-1、胱氨酸為50 μmol·L-1，其余各氨基酸濃度均為100 μmol·L-1。

2）磷酸鹽緩沖液。稱取19.0 g三水醋酸鈉，1.72 g三乙胺溶于1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.05，加適量EDTA，用0.45 μm濾膜過濾。

3）AQC衍生液。向AQC粉末瓶中加入1.25 mL乙腈，渦旋混合，在55 ℃條件下加熱至溶解。

4）硼酸鹽緩沖液。稱取12.36 g硼酸，加400 mL水溶解，用400 g·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.8，然后加水稀釋至500 mL，得到0.4 mol·L-1硼酸鹽緩沖液。

1.2.2 樣品制備

取茶葉鮮樣攪碎并混合均勻，稱取0.25 g，加入10 mL沸水，在90 ℃的水浴鍋中浸提20 min，冷卻至室溫后，3 000 r·min-1離心5 min，上清液加水定容10 mL，過0.45μm微孔濾膜后備用。

1.2.3 衍生化反應(yīng)

準(zhǔn)確移取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液或茶鮮葉樣品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，加入70 μL硼酸鹽緩沖液，渦旋混合。取20 μL AQC衍生液，在渦旋狀態(tài)下加入進(jìn)樣瓶中，渦旋混合10～20 s，靜置1 min后在55 ℃下加熱10 min，取出冷卻至室溫，供分析用。

1.2.4 儀器分離條件

色譜柱：Symmetry C18柱。柱溫37 ℃，流速2.0 mL·min-1。熒光檢測：激發(fā)波長250 nm、發(fā)射波長395 nm；進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相：A為磷酸鹽緩沖液，按l∶10用超純水稀釋；B為100%乙腈；C為100%超純水。梯度洗脫程序：0 min，100%A；0.5 min，98%A+2.0%B；0.5～9.0 min，96.5%A+3.5%B；9.0～

9.5 min，95.0%A+5.0%B；9.5～11.5 min，91.5%A+8.5%B；11.5～13.0 min，83.0%A+17.0%B（保持4 min）；17.0 min，60.0%B+40%C（保持2 min）；19～23 min，100%A。

1.2.5 定量測定

根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對樣品中的氨基酸定性，使用外標(biāo)曲線計(jì)算樣品中各氨基酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離

18種氨基酸混合標(biāo)液HPLC圖譜如圖1所示。從圖1可以看出，氨基酸各組分之間的分離度良好，出峰緊湊且峰形對稱，分析周期為23 min，在保證了分離效果的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了快速分析的目的和效果。

2.2 方法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

配制濃度分別為5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、250 μmol·L-1的氨基酸混標(biāo)溶液，衍生化后進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，在5～250 μmol·L-1范圍內(nèi)，氨基酸的濃度與其峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.997 8～0.999 9。

2.3 方法回收率

精密稱取0.25 g已知氨基酸含量的茶鮮葉樣品5份，向其中加入一定體積的氨基酸混合標(biāo)液，進(jìn)行樣品制備、衍生反應(yīng)后測定，采用外標(biāo)法定量，計(jì)算各氨基酸的回收率和RSD。

18種氨基酸的回收率在86.25%～109.05%，RSD在6.03%～10.56%，說明本方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，方法可靠。

2.4 方法精密度

取適量含18種氨基酸的混合標(biāo)液，按上述方法衍生后進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，以色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察其精密度。各氨基酸保留時(shí)間RSD在0.09%～0.55%，峰面積RSD在1.12%～2.15%，說明本方法精密度較高。

2.5 方法重復(fù)性

取同一茶鮮葉樣品5份，按上述方法提取、衍生、測定，以色譜峰面積超過1%的氨基酸的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)分別計(jì)算RSD，考察方法的重復(fù)性。茶鮮葉所含氨基酸峰保留時(shí)間RSD在0.55%～1.98%，峰面積RSD在2.08%～3.71%，重復(fù)性較好。

2.6 方法穩(wěn)定性

取同一茶鮮葉樣品供試溶液，按照上述方法衍生，分別在0 h、4 h、8 h、12 h和24 h進(jìn)樣，以色譜峰峰面積超過1.0%的氨基酸的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察茶鮮葉中氨基酸衍生化溶液的穩(wěn)定性。各氨基酸衍生化產(chǎn)物保留時(shí)間RSD在0.23%～2.01%（n=5），峰面積RSD在1.18%～3.91%（n=5）。表明氨基酸衍生化溶液在室溫下可以穩(wěn)定24 h。

3 方法應(yīng)用

應(yīng)用建立的方法，分別對蘇州洞庭東山和洞庭西山的2個(gè)碧螺春茶葉鮮樣中的游離氨基酸進(jìn)行測定.

4 結(jié)論

建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測器測定茶鮮葉中18種游離氨基酸含量的方法。將茶鮮葉樣品攪碎混勻，以超純水作為萃取溶劑，在90 ℃水浴下浸提20 min，以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為衍生劑柱前衍生化，使用Symmetry C18色譜柱梯度洗脫。同時(shí)，Symmetry C18柱價(jià)格便宜，專屬性不強(qiáng)，可以用于其他物質(zhì)的檢測，大大節(jié)約分析的成本，特別適合在廣大基層檢測機(jī)構(gòu)和單位推廣使用。

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（責(zé)任編輯：趙中正）