細管類型和距液氮面高度對豬精液冷凍保存效果的影響

薛琦

摘 要：本試驗探究了細管類型和細管距離液氮面高度對豬精液冷凍保存凍后存活率的影響。試驗結果表明：（1）0.5 mL細管冷凍保存豬精子的凍后存活率極顯著（P<0.01）高于0.25 mL細管冷凍保存豬精子的凍后存活率，0.5 mL細管組的凍后存活率為0.55±0.050，而0.25 mL細管組的凍后存活率為0.43±0.044 7。（2）距液氮面1.638 cm處冷凍保存豬精液得到的凍后存活率顯著（P<0.05）高于距液氮面2.162 cm處冷凍保存精液得到的凍后存活率。距液氮面1.638 cm時，凍后精子的存活率為0.58±0.130，距液氮面2.162 cm時，凍后精子的存活率為0.41±0.074。

關鍵詞：細管類型；距液氮面高度；豬精液；冷凍保存；精子存活率

中圖分類號：S828 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2018）04-0057-04

在豬生產(chǎn)中，由于豬精子對低溫更加敏感，豬輸精量大和豬精液常溫保存較為成功，使得豬精液冷凍保存的研究和應用停滯不前，嚴重地影響了種公豬優(yōu)良性能的充分發(fā)揮。近些年來，隨著低溫生物學以及犬、牛等動物精子冷凍保存技術的發(fā)展，現(xiàn)在對于豬精液冷凍保存的研究明顯增多，冷凍保存效果顯著提高，解凍后精子存活率超過0.5的研究報道比比皆是[1]。冷凍保存于液氮中的精子，其細胞代謝幾乎完全停止，理論上可以實現(xiàn)精子的長期保存，便于精液的長途運輸和交流，有利于良種的快速擴繁，對推動養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 豬新鮮精液采集

本實驗采集長白種公豬的新鮮精液，保證鮮精活率在0.85以上。種公豬來至靜寧縣四方種豬場。種公豬體格健壯，生殖能力正常。

1.1.2 儀器設備

離心機（型號GTL-20bR，上海飛鴿離心機有限公司產(chǎn)品），普通生物顯微鏡（型號XSP-2C，上海巴拓儀器有限公司產(chǎn)品），電暖器（型號NSA-7a，珠海格力電器股份有限公司），水浴鍋（型號HWS-12，上海一恒電器廠），移液器（規(guī)格100 μL～1 000 μL，北京智杰方遠科技有限公司），普通冰箱（型號：BCD-618W，海信科龍電器股份有限公司）。

1.1.3 試劑

Tris（貨號ZZ02531，Novon公司進口分裝產(chǎn)品），葡萄糖（分析純，批號20150603，山東浩中化工科技有限公司生產(chǎn)），檸檬酸（分析純，批號20140505，廊坊鵬彩精細化工有限公司生產(chǎn)），注射用青霉素鈉（批號H20143045，潤澤制藥有限公司產(chǎn)品），注射用硫酸鏈霉素（獸用，批號H37021948，瑞陽制藥有限公司產(chǎn)品）。

卵黃：自制。取新鮮雞蛋，用酒精棉球對蛋殼表面進行消毒，然后在大頭處打破蛋殼去除蛋清，均勻混合即可。

2 試驗方法

2.1 稀釋液制備

按表1，分別稱取Tris 3.04 g、葡萄糖 1.25 g、檸檬酸1.3 g、青霉素0.06 g、硫酸鏈霉素0.10 g，加入含有超純水的燒杯中，旋轉搖動燒杯，使加入的各種成分充分溶解并均勻混合，然后用100 mL容量瓶定容。定容后的基礎稀釋液放入17 ℃恒溫箱中待用。

稀釋液Ⅰ由80 mL基礎稀釋液和20 mL卵黃混合而成。

稀釋液Ⅱ則為含有6%甘油的稀釋液Ⅰ。

2.2 鮮精的采集及運輸

手握法采集豬的精液，盛于100 mL的塑料瓶，在1 h～2 h內(nèi)用毛巾包裹送回實驗室，放置在17 ℃的恒溫箱中保存?zhèn)溆?。運輸過程中要避免精液出現(xiàn)溫度的下降，還應防止精子的劇烈震蕩，以免影響精子的質(zhì)量。

2.3 鮮精和稀釋液的溫度平衡

將豬鮮精液和配置好的稀釋液I放入17 ℃的恒溫箱中2 h進行平衡，使稀釋液Ⅰ和鮮精溫度保持一致，達到一個溫度的平衡，為接下來的精液稀釋做好準備。

2.4 鮮精的稀釋和降溫

取平衡好溫度的豬精液4 mL于塑料指管中，用離心機2 000 r/min離心4 min，去除上清液；加入2 mL稀釋液Ⅰ，2 000 r/min離心 4 min，去上清液；加入4 mL稀釋液I，均勻混合后用藥棉封口，放入含有4 00 mL 17 ℃水的燒杯中，一起放入4 ℃的冷藏室過夜。同時，也將稀釋液Ⅱ放至冷藏室降溫平衡。

2.5 抗凍保護劑的平衡

按照等溫等量的原則，將過夜的稀釋液Ⅱ緩慢加入也已降溫至4 ℃的精液中，均勻混合后，放入冷藏室繼續(xù)平衡2 h～4 h。

2.6 豬精液的分裝

將精液吸入已降溫至4 ℃的0.5 mL的細管中，使精液吸至細管中部。每次分裝時應保證細管中精液長度大致相等，且整個分裝過程應在4 ℃條件下進行。

2.7 豬精液的冷凍和解凍

選取大小適中的泡沫塑料箱，倒入液氮至泡沫塑料箱容積的一半，放入特制的厚度為2.162 cm 或1.638 cm的泡沫塑料船。然后將分裝好的細管放置在塑料泡沫船上，蓋上泡沫箱，熏蒸10 min后，將細管投入液氮中冷凍保存2 min。冷凍結束后，用鑷子夾住細管一端（避免夾住裝有精液的細管中部），迅速放入45 ℃的水浴鍋中進行解凍10 s，解凍時防止水浴鍋中的水進入細管。

2.8 精子活率的檢查

解凍后的精液首先在37 ℃恒溫箱中放置 5 min，然后取1滴滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，蓋玻片和載玻片均已在37 ℃恒溫箱中平衡溫度。然后將其置于顯微鏡下觀察存活率。觀察時至少觀察5個不同視野，每個視野觀察10個精子，并記錄存活精子數(shù)，算出精子存活率?；盥蕶z測應盡量快，且選擇蓋玻片中間部位的視野進行測定。

3 數(shù)據(jù)處理

本試驗用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，并進行差異的F檢驗。所有數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標準差”來表示。

4 結果與分析

4.1 細管類型對豬精子凍后存活率的影響

在其他因素完全相同的情況下，我們僅就細管類型這個單一因素進行了試驗。由表2和圖1可知，在進行5次重復試驗后得到凍后精子存活率，0.5 mL細管組精子存活率平均為0.55±0.050，而0.25 mL細管組精子存活率平均為0.43±0.044 7。顯著性檢驗結果表明： 0.5 mL細管冷凍保存豬精液的精子存活率極顯著（P<0.01）高于使用0.25 mL細管冷凍保存豬精子的凍后存活率。可以看出，0.5 mL細管冷凍保存豬精液的效果要好于0.25 mL細管。

4.2 距液氮面高度對豬精子凍后存活率的影響

在其他因素完全相同的情況下，我們還對細管距液氮面的高度這個單一因素進行了試驗。從表3和圖2中得出，用0.25 mL細管時，距液氮面上方1.638 cm冷凍保存豬精液得到的凍后精子存活率顯著（P<0.05）高于距液氮面2.162 cm處冷凍保存得到的凍后精子存活率。距液氮面1.638 cm時，凍后精子的存活率為0.58±0.130，距液氮面2.162 cm時，凍后精子的存活率則為0.41±0.074。與距液氮面上方2.162 cm相比，距液氮面1.638 cm處冷凍保存豬精液的效果會更好。

5 討論

5.1 細管類型對豬精液冷凍保存效果的影響

目前常用的細管規(guī)格有0.25 mL、0.5 mL和5 mL，通常規(guī)格小的冷凍保存效果較好。Bwanga等[2]研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mL細管凍后精子活率明顯高于5 mL細管中精子的活率。Simmet等也對細管進行過對比研究，從凍后的精子活率以及頂體完整性等指標來看，0.25 mL和0.5 mL細管的冷凍保存效果都明顯優(yōu)于5 mL細管。

有關0.25 mL和0.5 mL細管間的比較研究則不多。從我們在-80 ℃的超低溫冰箱的冷凍保存研究結果來看，45 ℃×5 s解凍條件下，0.25 mL和0.5 mL的細管冷凍保存的豬精子，其凍后存活率之間沒有明顯的差異（P>0.05）。本研究則將豬的精液冷凍保存于-196℃的液氮中進行試驗的，結果發(fā)現(xiàn)0.5 mL細管冷凍保存豬精液的精子存活率極顯著（P<0.01）高于使用0.25 mL細管冷凍保存豬精液的精子存活率，0.5 mL細管冷凍保存的豬精子凍后存活率為0.55±0.050，使用0.25 mL細管冷凍保存的豬精液凍后存活率為0.43±0.044 7。可能是在 -80 ℃冷凍保存時，0.25 mL細管保存的豬精液在冷凍解凍過程中能夠更快地通過冰晶形成的高危區(qū)；而-196 ℃冷凍保存時，0.5 mL細管保存的豬精液在冷凍解凍過程中更快通過冰晶形成的高危溫度區(qū)所致。

5.2 距液氮面高度對豬精液冷凍保存效果的影響

我們知道，細胞冷凍過程中冰晶是造成細胞損傷和死亡的主要原因。冰晶形成的溫度區(qū)域是0～-60 ℃。在這一區(qū)域降溫速度越慢，形成的冰晶越大，對細胞的損害也越大。因此，在進行冷凍保存降溫時應快速通過危險溫度區(qū)而進入損害較小的玻璃化溫度區(qū)（-60 ℃～-250 ℃）。

精子需要在冷凍過程中控制好溫度的下降，總的來說，在冰晶形成的危險溫度區(qū)，降溫的速度要快，而在玻璃化的溫度區(qū)，降溫的速度則要慢。傳統(tǒng)的精子冷凍方法，即將細管精液置于液氮面上方2 cm～3 cm處用液氮熏蒸冷凍，正是實現(xiàn)快速通過冰晶形成的溫度區(qū)和緩慢通過玻璃化溫度區(qū)的具體舉措。細管精液距液氮面越近，溫度下降的就越快，通過冰晶形成的溫度區(qū)加快了，但通過玻璃化的溫度區(qū)的速度也加快了，這會造成破裂損傷，也會引起精子的死亡；細管精液距液氮面越遠，溫度下降的就越慢，通過玻璃化的溫度區(qū)的速度變慢了，這會通過冰晶形成的溫度區(qū)也變慢了，這會造成冰晶形成的增加，也加大了精子的損傷和死亡。為了尋找一個較為合適的距液氮面的高度，獲得豬精液更好的冷凍保存效果，我們設計了1.638 cm 和2.162 cm兩種高度進行了對比研究，結果表明，液氮面上方1.638 cm處冷凍保存的豬精子凍后存活率（0.58±0.130）顯著（P<0.05）高于液氮面上方2.162 cm處冷凍保存的豬精子凍后存活率（0.41±0.074）。

6 結論

（1）0.5 mL細管冷凍保存豬精液的凍后存活率明顯要好于0.25 mL細管。

（2）與液氮面上方2.162 cm相比，液氮面上方1.638 cm冷凍保存的豬精液，其凍后精子存活率顯著提高。

參考文獻：

[1] 張鐵剛，李然. 影響豬人工授精效果的主要因素[J]. 黑龍江動物繁殖，2013，21（6）：23-25.

[2] Hernandez M，Roca J，Calvete J J， Sanz L，Muino-Blanco T，Cebrian-Perez J A，Va Zquez J M，Martinez E. Cryosurvival and invitro fertilizing capacity post thaw is improved when boar spermatozoaare frozen in the presence of seminal plasma from good freezer boars. Journal of Andrology， 2007，28：690-697.