冷沉淀制備儀虹吸法與低溫水浴箱融化離心法制備冷沉淀的對(duì)比研究

揚(yáng)麗　陳健

[摘要] 目的 探討冷沉淀制備儀虹吸法制備冷沉淀的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用。方法 采集30袋全血，先分離出新鮮冰凍血漿冰凍保存。后解凍將其隨機(jī)等分成兩組，分別采用冷沉淀制備儀虹吸法及低溫水浴箱融化離心法制備冷沉淀，并按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)各組冷沉淀產(chǎn)品的纖維蛋白原和FⅧ因子含量進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果 冷沉淀制備儀虹吸法與低溫水浴箱融化離心法制備的冷沉淀質(zhì)量都符合質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)，但制備儀虹吸法生產(chǎn)的冷沉淀中纖維蛋白原和FⅧ因子的含量要比低溫水浴箱融化離心法高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 用冷沉淀制備儀虹吸法制備冷沉淀操作簡(jiǎn)單易行，安全可靠，省時(shí)、省力且其產(chǎn)品質(zhì)量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)并優(yōu)于低溫水浴箱融化離心法，有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 冷沉淀制備儀虹吸；水浴離心法；凝血因子；纖維蛋白原；FⅧ因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R457 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2018）06（b）-0173-02

冷沉淀（Cryoprecipitate）是臨床上成分輸血中的一種重要制品，該制品是新鮮冰凍血漿（FFP）在1～6℃條件下融化后分離出大部分血漿、剩下的冷不溶解活性物質(zhì)，在1 h內(nèi)速凍呈固態(tài)的成分血。冷沉淀富含纖維蛋白原（Fg）、凝血因子FⅧ、纖維結(jié)合蛋白、血管性血友病因子等成分，輸注后具有止血、抗感染、促進(jìn)傷口愈合及組織修復(fù)作用[1]。該制品在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛。筆者在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)使用冷沉淀制備儀虹吸制備冷沉淀比經(jīng)典低溫水浴箱融化離心法制備時(shí)間短、纖維蛋白原和凝血因子FⅧ回收率高，且操作簡(jiǎn)單簡(jiǎn)便，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ZBK-LCD-A1冷沉淀凝血因子制備儀（山東中保康公司）；賀利氏6000i 型大容量低溫離心機(jī)（德國(guó)theymo公司）；CT-4T.6C型低溫水浴融化箱（美國(guó)血技公司）；SE250高頻電子熱合機(jī)（韓國(guó)）；SPN1501F電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）；Sysmex CA-50型血凝儀（日本希森美康株式會(huì)社）；以下試劑均為德國(guó)西門(mén)子公司生產(chǎn)：標(biāo)準(zhǔn)血漿（Standard Plasma， 批號(hào)：503232C）、乏Ⅷ因子血漿（批號(hào)：546578A）、纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)試劑（Fbg， 批號(hào)：5308071）、氯化鈣（Cacl2， 批號(hào)：539716）、緩沖液（批號(hào)：547021）、APTT試劑（批號(hào)：547189A）。

1.2 冷沉淀凝血因子原料血漿

用山東威高集團(tuán)生產(chǎn)的白細(xì)胞除濾五聯(lián)袋（抗凝劑為CPDA-1）采集健康獻(xiàn)血者全血30人份、每份400 mL，且采集時(shí)間>13 min。將其隨機(jī)分為2組，每組15袋，在采集后8 h內(nèi)離心分離出新鮮血漿，并于-50℃速凍冰箱速凍，凍結(jié)完好后放置于-25℃以下低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。冷?4 h以上且在保存期內(nèi)的FFP 用于制備冷沉淀[2]，且FFP質(zhì)量符合GB18469-2012《全血及成分血質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的要求。

1.3 低溫水浴箱融化離心制備法

從-25℃低溫冰箱中取出15袋新鮮冰凍血漿，將其置于CT-4T.6C型低溫水浴融化箱6℃融化，當(dāng)血漿大部分融化，余有少許冰渣時(shí)將血漿袋取出，配平后離心。在溫度4℃、轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/分條件下，離心10 min。離心完畢分離出上層血漿，電子天平稱(chēng)重后余下約20～30 mL血漿和沉淀混合物即為冷沉淀凝血因子，熱合離斷后立即放置于-50℃深低溫冰箱中速凍。此過(guò)程需2～3人密切配合，并于2.5 h內(nèi)完成。

1.4 冷沉淀制備儀虹吸法制備法

按照冷沉淀制備儀說(shuō)明書(shū)操作，待水浴箱中水溫降至6℃并恒定，稱(chēng)重掛盒稱(chēng)重清零后，開(kāi)門(mén)將15袋新鮮冰凍血漿分別置于恒溫循環(huán)水槽中各個(gè)上掛盒處，空聯(lián)袋置于水浴箱外下方的各個(gè)下掛盒處，形成落差。點(diǎn)擊啟動(dòng)按鈕，待管路軟化后放入蠕動(dòng)泵和夾管閥內(nèi)，關(guān)閉夾管閥打開(kāi)止流夾。關(guān)門(mén)啟動(dòng)自動(dòng)制備程序。水浴箱的水循環(huán)流動(dòng)，冰凍血漿開(kāi)始融化，蠕動(dòng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)同時(shí)打開(kāi)夾管閥形成虹吸，融化的大部分血漿流入空袋中。當(dāng)上掛盒余下的血袋重量達(dá)到設(shè)定值70 g后冷沉淀制備儀會(huì)自動(dòng)稱(chēng)重并關(guān)閉夾管閥。每批次完成儀器自動(dòng)報(bào)警。開(kāi)門(mén)關(guān)閉止流夾，收取血袋，剩余的40～50 mL血漿和沉淀混合物即冷沉淀凝血因子，熱合離斷后立即放置于-50℃深低溫冰箱中速凍。此過(guò)程僅需1人操作，并且1 h即可完成。

1.5 標(biāo)本檢測(cè)及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

將2種方法制備的冷沉淀袋一并放入37℃水浴箱中融化，完全融化后從每袋中取樣2 mL，檢測(cè)其中的纖維蛋白原和FⅧ因子含量。按照GB18469-2012《全血及成分血質(zhì)量要求》規(guī)定，由200 mL新鮮冰凍血漿制備的冷沉淀（IU）：FⅧ含量>80 IU/袋，F(xiàn)g含量>150 mg/袋，容量：（25±5）mL，符合上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)者則為合格。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩種方法制備的冷沉淀各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但冷沉淀制備儀制備的冷沉淀中纖維蛋白原、FⅧ因子含量明顯高于離心法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。同時(shí)使用冷沉淀制備儀制備冷沉淀只需1 h左右，而離心法需2.5 h左右，時(shí)間大為縮短。

3 討論

成分輸血如今已廣泛應(yīng)用于臨床，冷沉淀就是其中最常見(jiàn)的一種成分血。冷沉淀含有多種凝血成分，對(duì)于甲型血友病、先天性或獲獲得性纖維蛋白原缺乏癥、血管性血友病等都有較好治療效果。此外，它對(duì)于外科患者，尤其是血友病患者的手術(shù)中出血有顯著地預(yù)防和治療作用[3-4]。因此，從冷沉淀原漿料開(kāi)始采集到臨床輸注過(guò)程中應(yīng)盡量減少其中活性凝血成分，尤其是纖維蛋白原和凝血因子FⅧ的破壞。

纖維蛋白原為比較穩(wěn)定的因子，而凝血因子FⅧ為不穩(wěn)定因子，其半衰期大約為8～12 h，極易失活[5]。根據(jù)現(xiàn)行2012年版《全血及成分血質(zhì)量要求》中規(guī)定，冷沉淀的原漿料應(yīng)為新鮮冰凍血漿，而FFP是由采集后的全血在8h以內(nèi)制成。但現(xiàn)有研究表明[6]，利用存儲(chǔ)24 h以內(nèi)的全血制成的冰凍血漿（FP）制備的冷沉淀，其含有的凝血因子水平與按標(biāo)準(zhǔn)程序制成的冷沉淀相當(dāng)，這是值得我們進(jìn)一步研究的問(wèn)題。同時(shí)，凝血因子FⅧ在1～6℃條件下，會(huì)從血漿中以沉淀性質(zhì)析出，但溫度一旦超過(guò)8℃，F(xiàn)Ⅷ因子則會(huì)再次溶解于血漿，影響其回收及活性。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]當(dāng)在6℃恒溫時(shí)冷沉淀中的FⅧ因子回收率最高。經(jīng)典低溫水浴融化離心法采用6℃低溫水浴箱融化新鮮冰凍血漿后經(jīng)過(guò)離心分離出冷沉淀。此法中水浴箱為一種敞開(kāi)環(huán)境，且離心過(guò)程中電機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)都會(huì)使制備過(guò)程溫度易受環(huán)境溫度影響而上升，有時(shí)甚至超過(guò)8℃，從而影響凝血因子，尤其是因子FⅧ的回收。并且離心法每批次制備時(shí)間需2.5 h左右，過(guò)程較繁瑣，環(huán)節(jié)多，同時(shí)需2～3人操作。而冷沉淀制備儀采用密閉低溫水浴融化箱融化新鮮冰凍血漿，有精密電腦控制水浴溫度恒定在6℃，保證了良好的融化環(huán)境。冷沉淀制備儀虹吸法擁有血袋固定掛盒，血袋可完全垂直浸沒(méi)在水中，不會(huì)相互粘附，且水浴箱擁有自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)，這都保證各血袋能受溫全面、均勻，能以穩(wěn)定速度融化。并且全過(guò)程電腦控制自動(dòng)稱(chēng)重，當(dāng)血袋重量達(dá)到設(shè)定值時(shí)會(huì)自動(dòng)關(guān)閉閥門(mén)并報(bào)警，僅需1人操作即可，每批次制備時(shí)間約需1 h。同時(shí)還可避免人為操作和人工稱(chēng)量誤差而影響凝血因子，尤其是纖維蛋白原和FⅧ因子的回收率。本研究中，兩種方法制備的冷沉淀質(zhì)量盡管都符合質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)，但制備儀虹吸法生產(chǎn)的冷沉淀中纖維蛋白原和FⅧ因子的含量要比低溫水浴融化離心法高，大大提高了產(chǎn)品質(zhì)量。同時(shí)，每單位體積冷沉淀中纖維蛋白原和FⅧ因子的含量增加可以減少病人使用冷沉淀的容量，從而減少輸注血液制品的副作用的發(fā)生。這對(duì)于確保冷沉淀的臨床輸血療效，防止無(wú)效輸注有著極其重要的意義。

可見(jiàn)，冷沉淀制備儀虹吸法制備冷沉淀不但克服了低溫水浴融化離心法操作步驟繁瑣、制備時(shí)間長(zhǎng)、溫度不恒定、工作效率低、人為因素影響多等缺點(diǎn)，而且凝血因子回收率高，基本實(shí)現(xiàn)了程序化控制的冷沉淀制備規(guī)范化操作，省時(shí)、省力，極大地提高了工作效率，而且產(chǎn)品質(zhì)量更可靠，大大提高了臨床輸血的安全性，值得大力推廣。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 楊孝順，安梅，阮光萍，等.冷沉淀在臨床外科手術(shù)中的應(yīng)用[J].中國(guó)輸血雜志，2005，18（3）：255-256.

[2] 陳均，李瓊芝，楊通漢，等.應(yīng)用半自動(dòng)血凝儀檢測(cè)冷沉淀中FⅧ：C含量[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2003，5（1）：35.

[3] 高志峰，胡麗華.冷沉淀融化后不同放置時(shí)間FⅧ和vWF水平的變化及意義[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（16）：2097-2098.

[4] Levy JH， Welsby I， Goodnough LT. Fibrinogen as a therapeutic target for bleeding： a review of critical levels and replacement therapy [J]. Transfusion，2014 ，54（5）：1389-1405.

[5] 高峰.輸血與輸血技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：160-161.

[6] Philip J， Kumarage S， Chatterjee T， et al. The possible advantages of cryoprecipitate prepared from fresh frozen plasma from blood stored for 24 hours[J].Laboratory Medicine，2014， 45（2）：111-115.

[7] 張國(guó)清，楊玉發(fā)，李庚娣.兩種融化方法制備冷沉淀比較[J].廣州醫(yī)藥，2007，37（3）：56-57.

（收稿日期：2018-03-12）