地衣芽胞桿菌HS10原生質(zhì)電轉(zhuǎn)化體系的研究

徐龍　黃文祥　劉紅霞

摘要

地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白對多種病原真菌具有防治效果，為挖掘其生防功能基因，本研究通過對原生質(zhì)體的制備、再生培養(yǎng)基、滲透壓穩(wěn)定劑、電擊參數(shù)等試驗條件進行優(yōu)化，建立了地衣芽胞桿菌HS10原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化法。結(jié)果表明最佳轉(zhuǎn)化條件為：轉(zhuǎn)接培養(yǎng)10 h達到對數(shù)生長后期的菌體，濃縮4倍后，利用終濃度1 mg/mL的溶菌酶，于37℃、150 r/min酶解20 min，酶解效率達到99.34%，1×SMM洗滌3次，調(diào)整菌濃度至1.0×108 cfu/mL，并通過1.6 kV、5 ms的電擊后，迅速在SMMP溶液中100 r/min、37℃恢復(fù)6～10 h，涂布于含Kan和Erm的再生培養(yǎng)基DM3平板。將該方法用于突變體庫構(gòu)建的質(zhì)粒pMarA（8 253 bp）和基因敲除質(zhì)粒pMADΔCP（13 043 bp）的大片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，分別獲得了37 cfu/μg DNA和10 cfu/μg DNA 陽性轉(zhuǎn)化子。該遺傳轉(zhuǎn)化體系為地衣芽胞桿菌HS10中相關(guān)基因功能的研究提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞

地衣芽胞桿菌； 原生質(zhì)體； 電轉(zhuǎn)化； 質(zhì)粒

中圖分類號：

Q 785

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017301

Studies on the electroporation system for Bacillus licheniformis

HS10 protoplast

XU Long， HUANG Wenxiang， LIU Hongxia

（College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

Bacillus licheniformis HS10 and its crude protein have good effects on various pathogenic fungi. In order to identify the functional genes， genetic manipulation is needed. Though the optimization of the protoplast preparation， regeneration medium， osmotic stabilizer， shock conditions and other experimental conditions， the electroporation method of protoplast was set up in this paper. The experimental results showed that the optimum reaction conditions were as followed： The cells at logarithmic growth period after transferred for 10 h were concentrated by 4 times， and then subjected to enzymolysis for 20 min with a final concentration of 1 mg/mL lysozyme at 37℃ and 150 r/min. Enzymolysis rate reached 99.34%. The products of enzymolysis were washed for three times with 1× SMM and adjusting the concentration to 1.0×108 cfu/mL. After electroporation at 1.6 kV and 5 ms， with 0.5 mol/L sucrose as osmotic stabilizer， the cells were quickly restored for 6-10 h in SMMP solution， then coated on DM3 resistant plate. In the largefragment transformation using the plasmids pMarA （8 253 bp） and pMADΔCP（13 043 bp）， we obtained 37 cfu/μg DNA and 10 cfu/μg DNA positive transformants. This study established a genetic transformation system for the genetic manipulation of Bacillus licheniformis HS10.

Key words

Bacillus licheniformis； protoplast； electroporation； plasmid

地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis具有完善的蛋白表達系統(tǒng)、豐富的代謝產(chǎn)物以及對多種病原微生物具有拮抗能力的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于病害生物防治、蛋白酶工業(yè)、工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域[12]。已有研究表明：地衣芽胞桿菌對農(nóng)作物的真菌性病害，如灰霉病[3]、油菜菌核病[4]、柑橘炭疽病及蘋果輪紋病[5]等有較好的防治效果。因此，地衣芽胞桿菌是最具應(yīng)用開發(fā)潛力的芽胞桿菌之一。

Bacillus licheniformis HS10分離于黃瓜根際，對黃瓜霜霉病的田間防效達到40%～60%，Wang等發(fā)現(xiàn)該菌株及其蛋白粗提取物對小麥赤霉病菌Fusarium graminearum、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、小麥根腐病菌Bipolaris sorokiniana等多種病原真菌均具有拮抗作用，通過對其粗蛋白進行純化分析和GCMS鑒定，發(fā)現(xiàn)起拮抗作用的是類羧肽酶蛋白[6]。為深入探究該菌株防病抑菌機理，挖掘功能基因，需要對菌株進行基因水平的遺傳操作。

野生地衣芽胞桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)多借鑒枯草芽胞桿菌，已報道的轉(zhuǎn)化方法主要有原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法[7]和電轉(zhuǎn)化法[8]。但由于感受態(tài)形成缺陷、限制性修飾系統(tǒng)、菌株差異等特性，使得菌株轉(zhuǎn)化較為困難[910]。我們前期試驗中嘗試了化學(xué)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法，以及溫賽等[11]提出的原生質(zhì)電轉(zhuǎn)化法，均未獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

針對該問題，本研究利用正交試驗優(yōu)化了原生質(zhì)體制備中各影響因素，分析確定了最適酶解條件，并針對原生質(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定劑、恢復(fù)條件、電擊條件等因素進行了摸索，實現(xiàn)了用于突變體庫構(gòu)建的pMarA（8 253 bp）質(zhì)粒和用于基因敲除的pMADΔCP （13 043 bp）大片段重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。建立了地衣芽胞桿菌HS10轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)深入機理探究、工程菌株構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

Bacillus licheniformis HS10、DH5α為本實驗室保存。pMarA質(zhì)粒為高學(xué)文教授課題組饋贈。pMAD載體[12]為本實驗室保存，pMADΔCP為本實驗室構(gòu)建的，用于HS10中類羧肽酶基因的敲除質(zhì)粒。

1.1.2 試劑

溶菌酶（lysozyme）購于Sigma公司。取1 g用菌體保護液SMMP溶解，定容至10 mL，配制成100 mg/mL，并使用0.22 μm濾器除菌，-20℃分裝保存?？敲顾兀↘an）和紅霉素（Erm）購于南京鼎思生物科技公司?？敲顾赜胐dH2O溶解配制成50 mg/mL，過0.22 μm濾器除菌；紅霉素用無水乙醇溶解配制成5 mg/mL，過0.22 μm濾器除菌。

LB：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，10 g/L NaCl，pH 7.2，15 g/L瓊脂；SOB培養(yǎng)基：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，0.5 g/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2；SOC培養(yǎng)基：SOB中添加20 mmol/L葡萄糖。

4×PAB：6 g/L牛肉膏，6 g/L酵母浸粉，20 g/L胰蛋白胨，19.3 g/L K2HPO4·3H2O，5.3 g/L KH2PO4，14 g/L NaCl，120℃滅菌，加50%葡萄糖8 mL。

2×SMM：4.6 g/L馬來酸（順丁烯二酸），8.1 g/L MgCl2·6H2O，pH 6.5，滅菌后加入終濃度為1 mol/L蔗糖。1×SMM：2×SMM與dd H2O等體積混勻。

菌體保護液SMMP：4×PAB與2×SMM等體積混合后加入2%BSA（注：2×SMM含有1 mol/L蔗糖，因此SMMP中蔗糖終濃度為0.5 mol/L，即以0.5 mol/L蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑）；其他菌體保護液：分別用終濃度為0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇、10%甘油、0.5 mol/L海藻糖、1 mol/L琥珀酸鈉、0.5 mol/L蔗糖+0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L甘露醇+0.38 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇+0.5 mol/L海藻糖或0.75 mol/L甘露醇代替0.5 mol/L的蔗糖作為SMMP的滲透壓穩(wěn)定劑，其他組分不變，配制成含不同穩(wěn)定劑的菌體保護液。

DM3再生培養(yǎng)基：5 g/L水解酪蛋白，1.5 g/L KH2PO4，4.6 g/L K2PO4·3H2O，162.05 g/L琥珀酸鈉，10 g/L淀粉，5 g/L酵母浸粉，8 g/L瓊脂，5 g/L葡萄糖，0.09 g/L BSA，0.02 mol/L MgCl2，（葡萄糖、MgCl2單獨滅菌后加入）；RD再生培養(yǎng)基：1 g/L （NH4）NO3，3.5 g/L K2HPO4，1.5 g/L KH2PO4，81 g/L琥珀酸鈉，5 g/L明膠，4.07 g/L MgCl2·6H2O，5 g/L葡萄糖，8 g/L瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 菌體生長曲線的測定

使用LB平板活化超低溫保存的地衣芽胞桿菌HS10，于37℃培養(yǎng)1 d，挑取單菌落接種于含LB試管中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h后，按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB中（250 mL三角瓶）繼續(xù)培養(yǎng)，每小時取樣，檢測培養(yǎng)物OD600，記錄分析。

1.2.2 HS10原生質(zhì)體的制備

挑取轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4、6、8、10 h的菌體，離心收集菌體并用1/4體積SMMP重懸，使用終濃度1 mg/mL的溶菌酶于37℃處理20 min，獲得原生質(zhì)化的HS10菌體。酶解后直接稀釋涂布LB平板計數(shù)，以未酶解處理的對照作總菌量。

原生質(zhì)體形成率=[1-（酶解后菌量/總菌量）]×100%。

1.2.3 HS10原生質(zhì)體的再生與恢復(fù)

由上述方法制備的原生質(zhì)體，使用含有0.5 mol/L蔗糖的SMMP恢復(fù)培養(yǎng)4 h，涂布相應(yīng)平板，檢測各滲透壓穩(wěn)定劑下菌體恢復(fù)情況。

1.2.4 HS10原生質(zhì)體的電轉(zhuǎn)化與恢復(fù)

將制備好的原生質(zhì)體于4℃，5 000 r/min離心10 min，使用預(yù)冷的1×SMM溶液反復(fù)漂洗3次，之后使用1×SMM重懸，調(diào)整菌濃度為1.0×108cfu/mL。將原生質(zhì)體以100 μL分裝，電擊前加入4 μL 250 ng/μL pMarA質(zhì)粒混勻（即1 μg質(zhì)粒），置于冰上5 min后，使用預(yù)冷的2 mm電擊杯，設(shè)置1.6～2.5 kV，5 ms，進行電擊轉(zhuǎn)化，電擊后迅速加入1 mL預(yù)冷的SMMP恢復(fù)培養(yǎng)液，于37℃，100 r/min培養(yǎng)6～10 h后，涂布于含卡那霉素Kan （10 mg/mL）和紅霉素Erm（5 mg/mL）的固體DM3培養(yǎng)基上。每個試驗重復(fù)3次。（電擊儀使用Eppendorf的Multiporator多功能細胞電穿孔儀，電阻為系統(tǒng)設(shè)定值）。

1.2.5 質(zhì)粒的提取和細菌基因組DNA提取

菌體質(zhì)粒的提取參照AxyPrep小量質(zhì)粒提取試劑盒APMNP250的使用說明。地衣芽胞桿菌基因組DNA提取參照Tiangen細菌基因組DNA提取試劑盒DP30202的使用說明。

1.2.6 陽性轉(zhuǎn)化子的驗證

利用pMarA構(gòu)建地衣芽胞桿菌HS10隨機突變體庫的方法，以及陽性轉(zhuǎn)化子的驗證所使用的引物oTNP1和oTNP2參考Le Breton等[13]，引物kanF和kanR為本實驗室設(shè)計。

轉(zhuǎn)化子的PCR驗證參考TaKaRa的rTaq酶產(chǎn)品說明，程序為95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃ 10 min。酶切驗證參考TaKaRa限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品說明。

1.2.7 試驗統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用DPS 7.05軟件進行單因素方差分析，LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長曲線的測定

不同菌齡的菌體其生長狀態(tài)、胞內(nèi)外合成物質(zhì)、對外界條件的敏感性均存在差異。對HS10進行生長曲線測定（圖1），可以看到：當(dāng)按1%菌量，37℃、200 r/min轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4 h后，菌體開始進入對數(shù)生長期，10 h后達到對數(shù)生長后期，之后進入穩(wěn)定期。

2.2 HS10原生質(zhì)體制備最佳條件正交試驗

對不同試驗條件下原生質(zhì)體的形成情況進行分析，結(jié)果表明，地衣芽胞桿菌原生質(zhì)體制備過程中最為重要的影響因素是溶菌酶濃度。在0.1 mg/mL的濃度下，原生質(zhì)體的形成率，即酶解效率多為80%以下，而1 mg/mL濃度下能達到95%以上，但隨著溶菌酶濃度的繼續(xù)增加，原生質(zhì)體的形成率并沒有明顯差異（表2）。同時，原生質(zhì)體的形成率隨著菌齡的增加而增加，表明隨著菌體的成熟，其對溶菌酶也越來越敏感。為保證獲得足夠多的原生質(zhì)體，又不至于由于使用過高的溶菌酶濃度和酶解時間導(dǎo)致菌體的再生恢復(fù)能力降低，并考慮到后續(xù)試驗中菌量和滲透壓穩(wěn)定劑等因素，最終選擇HS10最佳酶解條件為：轉(zhuǎn)接培養(yǎng)10 h，將菌體濃縮4倍后，使用1 mg/mL終濃度的溶菌酶于37℃、150 r/min酶解20 min，以此獲得最佳原生質(zhì)體。

2.3 HS10原生質(zhì)體最佳恢復(fù)條件

進一步分析滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體再生的影響可知，按上述優(yōu)化的酶解條件，酶解并恢復(fù)4 h后，以0.5 mol/L蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑，恢復(fù)的菌體量最大，能夠達到8.5×107cfu/mL，隨后依次是0.5 mol/L甘露醇（7.4×107 cfu/mL）、10%甘油（6.8×107 cfu/mL）、0.5 mol/L山梨醇（6.7×107 cfu/mL）、0.5 mol/L海藻糖（6.2×107 cfu/mL）、1 mol/L琥珀酸鈉（5.8×107 cfu/mL）、0.5 mol/L蔗糖+0.5 mol/L海藻糖（4.0×107 cfu/mL）、0.5 mol/L甘露醇+0.38 mol/L山梨醇（2.9×107 cfu/mL）、0.5 mol/L甘露醇+0.5 mol/L海藻糖（1.7×107 cfu/mL）、0.75 mol/L甘露醇（1.5×107 cfu/mL）（圖2）。

由試驗結(jié)果可以看出，過高濃度滲透壓穩(wěn)定劑并不有利于菌體的恢復(fù)再生，再生的菌量甚至低于SMMP（H2O）條件，同時可以看出，在無滲透壓穩(wěn)定劑的條件下，依然有大量的菌體恢復(fù)擴增，甚至優(yōu)于過高滲透壓條件。故在后續(xù)的電擊試驗和菌體恢復(fù)中，采用0.5 mol/L蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑。

將SMMP溶液中恢復(fù)的菌體稀釋涂布于不同的培養(yǎng)基中，可以看出：DM3由于其營養(yǎng)豐富，最有利于菌體細胞壁的再生和恢復(fù)，而LB、SOB、SOC培養(yǎng)基并不是最佳選擇（圖3）。同時相較于RD培養(yǎng)基，DM3中菌體的恢復(fù)量高于RD再生培養(yǎng)基，菌體在平板上生長也更加圓潤和健康，因此選擇DM3作為再生培養(yǎng)基。

2.4 電擊強度對HS10原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響

本研究采用瞬間電擊實現(xiàn)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，此過程對原生質(zhì)體的傷害會影響原生質(zhì)體的恢復(fù)再生，過低的電壓無法產(chǎn)生合適的穿孔，而過高的電壓又會導(dǎo)致菌體大量死亡。由圖4可以看出，原生質(zhì)體在電擊并恢復(fù)4 h后，恢復(fù)的菌量隨電擊強度的增強而減少，菌量依次為：1.6 kV時1.9×107 cfu/mL、2.0 kV時1.0×107 cfu/mL、2.5 kV時7.0×106 cfu/mL。原生質(zhì)體對電擊強度較敏感，原生質(zhì)體受到的傷害隨著電擊強度增加而增加。因此選擇較低的1.6 kV的電壓更為合適。

電壓優(yōu)化試驗顯示，原生質(zhì)體在不同電壓條件下獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)分別為：0.8 kV時7 cfu/μg DNA、1.2 kV時21 cfu/μg DNA、1.6 kV時37 cfu/μg DNA、2.0 kV時18 cfu/μg DNA、2.5 kV時9 cfu/μg DNA（圖5）。原生質(zhì)體在1.6 kV電壓條件下獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)最多。1.6 kV以下，電壓與轉(zhuǎn)化效率呈正比，1.6 kV以上呈反比?？赡茉驗檫^強的電壓條件會導(dǎo)致部分菌體受傷嚴(yán)重，無法進行菌體細胞壁再生恢復(fù)，或菌體恢復(fù)較慢，導(dǎo)致在涂布抗生素平板后，菌體無法生長。由此可知最佳的電擊條件為1.6 kV，5 ms。

2.5 質(zhì)粒大小對HS10原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響

在此之后，又對該菌株進行了更大質(zhì)粒的電擊轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pMADΔCP，質(zhì)粒大小為13 043 bp。結(jié)果顯示質(zhì)粒大小對轉(zhuǎn)化效率有一定影響，pMADΔCP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子顯著少于pMarA質(zhì)粒（表3）。

2.6 陽性轉(zhuǎn)化子的驗證

將穿梭載體pMarA、pMADΔCP轉(zhuǎn)化入HS10中，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行PCR和酶切驗證。結(jié)果如圖6所示：用Kpn I分別對pMarA和HS10pMarA質(zhì)粒酶切后，都形成了2個大小為1.5 kb和6.5 kb的片段，PCR擴增pMarA和HS10pMarA質(zhì)粒中的Himar 1轉(zhuǎn)座酶基因，都得到長度為1.5 kb的片段，擴增TnYLB1中的Kan基因，都形成了370 bp的片段。在對pMADΔCP質(zhì)粒的檢測中，使用BgI II/Nco I雙酶切，均能產(chǎn)生3 600 bp的片段。上述結(jié)果表明：pMarA、pMADΔCP質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌HS10菌株中。

提取突變體菌株的基因組，擴增轉(zhuǎn)座子TnYLB1中的Kan片段，由圖7可以看出，隨機挑選的15個突變體基因組中均含有370 bp大小的片段，證實TnYLB1成功插入到HS10基因組中。

3 討論

地衣芽胞桿菌已報道的轉(zhuǎn)化方法主要有“原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法”和“高滲透電轉(zhuǎn)化法”[78]。聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法的原理是聚乙二醇能夠黏合細胞、擾亂細胞膜雙分子層，并能夠吸附溶液中的水分子使外源DNA和細胞膜形成分子橋，促進相互之間的接觸連接，從而導(dǎo)入外源DNA實現(xiàn)轉(zhuǎn)化[1415]。高滲透電轉(zhuǎn)化法則是利用瞬間電壓實現(xiàn)電穿孔，從而利于外源質(zhì)粒導(dǎo)入菌體。前者反應(yīng)較為溫和，后者存在細胞壁阻礙，在二者均無法成功轉(zhuǎn)化時可選擇原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化法，在打破細胞壁阻礙的同時，利用電穿孔增加外源DNA導(dǎo)入菌體的機會，使得轉(zhuǎn)化更為高效可行。但該法較為繁瑣，需要對原生質(zhì)體的制備、電擊條件、原生質(zhì)體的恢復(fù)再生等條件進行優(yōu)化才能達到最佳的轉(zhuǎn)化效率[10]。

在原生質(zhì)體制備中，除菌體生長狀態(tài)外，溶菌酶濃度、酶解時間、酶解溫度也是重要影響因素[7]。溶菌酶濃度過高、時間太長均會導(dǎo)致脫壁太徹底，不利于菌體的再生恢復(fù)，而溶菌酶濃度過低、時間太短，又會因酶解不徹底而影響轉(zhuǎn)化。溫賽等對影響酶解的條件進行了單因素逐一分析[10]，本論文選用4因素4水平的正交試驗進行原生質(zhì)體制備的優(yōu)化，并得出最佳條件為：取對數(shù)生長后期菌體，濃縮4倍后使用終濃度1 mg/mL的溶菌酶于37℃、150 r/min酶解20 min，酶解率達到99.34%。優(yōu)化后的條件及研究方法對其他野生地衣芽胞桿菌原生質(zhì)體的制備具有參考價值。

電擊后的恢復(fù)培養(yǎng)是受傷的菌體恢復(fù)再生的重要時期，酶解液、電擊緩沖液、恢復(fù)培養(yǎng)液均需使用合適的滲透壓穩(wěn)定劑，以維持受損細胞的形態(tài)，避免吸水脹破。Junichi等報道稱，無機鹽作為滲透壓更有利于原生質(zhì)體的形成，但糖醇類物質(zhì)更有利于原生質(zhì)體的再生[1617]。試驗得出0.5 mol/L蔗糖最有利于HS10菌體的恢復(fù)，0.5 mol/L甘露醇僅次于0.5 mol/L的蔗糖。需要指出的是：該結(jié)果不能等同于原生質(zhì)在不同滲透壓穩(wěn)定劑下的恢復(fù)率，因為原生質(zhì)體在4 h的恢復(fù)過程中，存在菌體的擴增，包括未原生質(zhì)化菌體和再生菌體的擴增。在電壓條件優(yōu)化方面，選擇1.6 kV，5 ms進行電轉(zhuǎn)化能降低對菌體的傷害，又能保證較高的轉(zhuǎn)化效率。優(yōu)化的滲透壓穩(wěn)定劑和電轉(zhuǎn)化條件對其他野生地衣芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化具有借鑒意義。不足之處在于，只對pMarA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化進行了電壓摸索和優(yōu)化，未能在更大片段的pMADΔCP（13 043 bp）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化中進一步優(yōu)化電壓。

在對不同野生菌株進行轉(zhuǎn)化時，會因為各種原因?qū)е罗D(zhuǎn)化失敗，例如：原生質(zhì)體制備不佳、滲透壓穩(wěn)定劑不合適、電轉(zhuǎn)電壓過高導(dǎo)致死亡、電壓過低無法形成很好的穿孔、菌體恢復(fù)時間過短、菌體洗滌不干凈導(dǎo)致?lián)舸?、菌濃度過高導(dǎo)致電擊效率不佳，甚至操作時間過長等。因此，在實際操作中，應(yīng)視情況做相應(yīng)的調(diào)整。綜上，本試驗通過對野生地衣芽胞桿菌HS10原生質(zhì)體制備、電轉(zhuǎn)化、恢復(fù)等過程進行了優(yōu)化，成功實現(xiàn)了高效率的轉(zhuǎn)化，為后續(xù)地衣芽胞桿菌HS10基因改造、防病機理的探究等打下基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）