榨菜根腫病生防細菌的篩選、鑒定及評價

蔣歡 彭玉梅 閆玉芳 張勇 吳朝君 何本洪 王旭祎

摘要 近年來，由于十字花科根腫病在榨菜上擴展蔓延，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量，造成巨大的經(jīng)濟損失。本研究篩選生防菌并研究其對榨菜根腫病的控制作用，為其生物防治應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)莖瘤芥等十字花科蔬菜根腫病菌根經(jīng)過腐爛處理后，休眠孢子的萌發(fā)率可到達70%以上。故本文采用稀釋法從榨菜根腫病菌根中分離篩選出一株可刺激休眠孢子萌發(fā)的菌株P(guān)B19。并測定了PB19與根腫病菌互作的最適溫度和最適pH，溫室盆栽試驗和大田小區(qū)試驗測定菌株P(guān)B19對榨菜根腫病的防治效果。最后將純化后的菌株送至中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測中心（FMIC）進行種屬鑒定。結(jié)果表明： PB19與根腫菌互作的最適溫度為20～25℃，最適pH為5.5～7.0。溫室盆栽結(jié)果顯示PB19對榨菜根腫病的防治效果為71.96%。而大田試驗結(jié)果顯示PB19對榨菜根腫病的防治效果為18.04%。FMIC的鑒定結(jié)果顯示PB19為假單胞菌屬Pseudomonas sp.。

關(guān)鍵詞 榨菜； 根腫??； 生防細菌； 假單胞菌； 生物防治

中圖分類號： S 436.37

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017270

Abstract In recent years， due to the spread of the Cruciferae clubroot in mustard， it has seriously affected its production and caused great economic loss. Biocontrol bacteria has been screened and studied for control of mustard clubroot， laying a foundation for its application in biological control. Some studies have found that the germination rate of the dormant spores could reach more than 70% after the decay process of the root of cruciferous vegetables. Here the strain PB19 was isolated from the mustard clubroot， which could stimulate the germination of resting spores by dilution method. First， the optimum temperature and pH value for the interaction between PB19 and Plasmodiophora brassicae were measured. The control efficiency of PB19 against clubroot of mustard was evaluated in pot experiments and field plot experiments. The strain was identified by Microbiology Identification Center of CNRIFFI （FMIC）. The test results showed that the optimum temperature for the interaction between PB19 and P.brassicae was 20-25℃，and the suitable pH value was 5.5-7.0. The control efficiency of PB19 against clubroot of mustard was 71.96% in pot experiments， and only 18.04% in field plot experiments. PB19 was identified as Pseudomonas sp. by FMIC.

Key words mustard； clubroot； antagonistic bacterium； Pseudomonas sp.； biological control

榨菜Brassica juncea var. tumida Tsen & Lee又名莖瘤芥、莖用榨菜，是人們?nèi)粘Ｉ钪幸环N重要的鮮食及加工蔬菜，是重慶市涪陵區(qū)的特色農(nóng)業(yè)資源和重點發(fā)展的蔬菜品種。近年來，由于十字花科根腫病在榨菜上擴展蔓延，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量，造成巨大的經(jīng)濟損失。涪陵區(qū)于1994年首次發(fā)現(xiàn)榨菜根腫病，隨后該病迅速擴展蔓延，危害日趨加重[1]，根據(jù)王旭祎等[2]對榨菜根腫病的調(diào)查結(jié)果，涪陵沿江19個榨菜主栽鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，有10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)受到根腫病危害，其中，重病區(qū)發(fā)病田塊占調(diào)查田塊的80%，病株率為50%以上，少數(shù)田塊死苗絕收。

十字花科根腫病俗稱根癌病，是由蕓苔根腫菌Plasmodiophora brassicae引起的一種重要的世界性土傳病害[35]。寄主范圍廣，可危害榨菜、大白菜、甘藍、蘿卜和花椰菜等多種栽培以及野生的十字花科植物[6]。國內(nèi)外已針對該病原菌進行了大量防治技術(shù)的研究，包括抗病品種選育[78]、農(nóng)業(yè)[910]和化學(xué)防治[1112]、生物防治[1314]，其中生物防治因具有對人畜安全，環(huán)境兼容性好且病菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點而被重視并初見成效。

研究發(fā)現(xiàn)莖瘤芥等十字花科蔬菜根腫病菌根經(jīng)過腐爛處理后，休眠孢子的萌發(fā)率可達到70%以上[1518]，菌根材料先經(jīng)-20℃冷凍保存，再進行腐爛處理，由此獲得的休眠孢子囊萌發(fā)率比材料未經(jīng)腐爛處理獲得的休眠孢子囊萌發(fā)率高[19]，但新鮮菌根直接腐爛處理比冷凍后腐爛處理萌發(fā)率更高[20]。肖崇剛等[18]在鏡檢腐爛菌根時觀察到大量細菌存在，認(rèn)為可能是由于腐爛處理時細菌的作用改變了根腫病菌休眠孢子細胞壁的透性，

從而提高了萌發(fā)率。因根腫菌是一種專性寄生菌，其休眠孢子囊在適宜的條件下萌發(fā)，釋放出游動孢子，如果短時間內(nèi)沒有可供侵染的寄主組織，就會喪失侵染能力。這為我們提供了一種根腫病防治新的思路，利用生物防治技術(shù)廣泛篩選能夠促進菌根快速腐爛和孢子萌發(fā)的微生物，在寄主收獲后，施用此類微生物促進殘留在土壤中的病殘體迅速腐爛并刺激其休眠孢子萌發(fā)，從而降低田間菌源量。

綜上所述，本文旨在從腐爛的菌根中分離篩選出能促進菌根快速腐爛并刺激休眠孢子萌發(fā)的微生物，利用病原菌只能活體培養(yǎng)的特性，使萌發(fā)后的孢子找不到寄主而喪失侵染能力，從而降低根腫病田間菌源量，達到減輕根腫病危害程度的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

供試榨菜品種為‘涪雜2號。供試根腫病菌根采自重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院根腫病試驗田，放置冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩＾卓辜毦肔B培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 菌根的腐爛處理

將-20℃保存的榨菜菌根于25℃恒溫黑暗條件下腐爛處理5 d。

1.3 致腐微生物的初步篩選

將腐爛處理后的菌根于榨汁機，按菌根組織與蒸餾水質(zhì)量比1∶5加入蒸餾水，充分絞碎，用蒸餾水稀釋到10-1～10-6后，每個濃度取50 μL涂布于LB平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（用LB培養(yǎng)基將OD值調(diào)至1.0）后接種于-20℃保存的根腫菌根上（將菌根切成大小均等的塊狀，每塊菌根接種500 μL菌液），于25℃恒溫以及黑暗條件下腐爛處理，每天觀察菌根的腐爛情況，觀察2 d根據(jù)腐爛速度初步篩選致腐微生物。

將篩選出的微生物進行數(shù)次劃線純化，以得到純培養(yǎng)的菌株，將純化后的菌株再接種菌根（不接種的菌根作為對照），于25℃恒溫黑暗條件下腐爛處理2 d后，按照吳道軍[19]的方法制備根腫病菌休眠孢子懸浮液，于顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，根據(jù)公式：孢子萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子數(shù)/調(diào)查總孢子數(shù)×100%，得到孢子萌發(fā)率，萌發(fā)率高的就是我們所需要的微生物。

1.4 生防菌與根腫病菌互作的最適溫度研究

1.4.1 根分泌物的收集

將榨菜種子在24℃條件下催芽2 d，播種在盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的100 mL小燒杯的紗布上，每杯播20粒，在24℃恒溫培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)7 d后收集含根分泌物的溶液，0.22 μm細菌過濾器過濾后4℃保存?zhèn)溆?，用于休眠孢子萌發(fā)試驗。

1.4.2 孢子懸浮液的制備

休眠孢子懸浮液的制備結(jié)合肖崇剛等[18]和郭向華[22]的方法。

1.4.3 生防菌培養(yǎng)液的制備

將活化后的菌株接種在LB培養(yǎng)基中，置于28℃的搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)，3 d后得到菌株培養(yǎng)液。

1.4.4 生防菌與根腫病菌互作的最適溫度

將制備的孢子懸浮液用根分泌物調(diào)節(jié)濃度至107個孢子/mL，按孢子懸浮液和生防菌培養(yǎng)液體積比10∶1加入生防菌培養(yǎng)液，于5、10、15、20、25、30、35℃黑暗培養(yǎng)3 d后，于顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，以不加生防菌為CK。

1.5 生防菌與根腫病菌互作的最適pH

根分泌物的收集、孢子懸浮液的制備以及生防菌培養(yǎng)液的制備同1.4。將制備的孢子懸浮液用根分泌物調(diào)節(jié)濃度至107個孢子/mL，按孢子懸浮液和生防菌培養(yǎng)液體積比10∶1加入生防菌培養(yǎng)液，用KOH和HNO3調(diào)節(jié)pH至3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0，以不加生防菌為CK，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后顯微鏡下鏡檢孢子萌發(fā)情況。

1.6 室內(nèi)防效試驗

將-20℃冰箱內(nèi)保存的根腫材料解凍后洗凈、瀝干水分、切碎，與無菌營養(yǎng)土按質(zhì)量比1∶5（W∶W）的比例混勻后，分裝至8 cm×8 cm的營養(yǎng)缽中，進行以下處理，處理1：每缽澆灌生防菌培養(yǎng)液10 mL，與處理3同時播種，共處理30缽。處理2：每缽澆灌生防菌培養(yǎng)液10 mL，7 d后再次每缽澆灌生防菌培養(yǎng)液10 mL，與處理3同時播種，共處理30缽。處理3，每缽澆灌生防菌培養(yǎng)液10 mL，7 d后和14 d后再次每缽澆灌生防菌培養(yǎng)液10 mL，21 d后播種，共處理30缽。另設(shè)置清水對照（CK）和發(fā)病對照（DK，不澆灌生防菌培養(yǎng)液）。每處理3次重復(fù)。所有處理播種前均置于25℃光照培養(yǎng)箱（光照16 h，黑暗8 h）。

所有幼苗置于溫度24℃，光照16 h條件下培養(yǎng)，保持土壤濕度，以育苗盤底部始終保持有少量水為宜。50 d后拔出幼苗，調(diào)查、記錄根部發(fā)病情況，參照吳道軍[19]所用的0～9級分級標(biāo)準(zhǔn)進行分級。

病株率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑（發(fā)病級代表值×各級病株數(shù)）×100/（調(diào)查總株數(shù)×最高級發(fā)病代表值）；

防治效果=[（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

1.7 田間防效試驗

試驗地為渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院根腫病重病田，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個小區(qū)長4 m，寬1.7 m，移栽60株。試驗作如下處理，處理1：榨菜移栽前1個月澆灌生防菌培養(yǎng)液，每隔7 d澆1次，每窩澆100 mL，共澆3次。處理2（清水對照）：用清水替代生防菌培養(yǎng)液，澆灌方法同處理1。處理3（陽性對照）：用23% GZB（一種防治十字花科蔬菜根腫病的藥劑，有效成分為甲噻誘胺+科家，使用劑量為10 mL原液兌水15 kg）替代生防菌培養(yǎng)液，澆灌方法同處理1。每處理3次重復(fù)。榨菜移栽后，田間常規(guī)管理，待植株成熟后，調(diào)查發(fā)病情況。

榨菜根腫病田間分級標(biāo)準(zhǔn)[21]分為5級。0級：無腫瘤。1級：側(cè)根發(fā)病，腫瘤小而少，白色，對植株生長無或有輕微影響，產(chǎn)量損失為0～5%。2級：主根中下部腫瘤小或側(cè)根上腫瘤大而多，呈白色或米黃色，對植株生長有一定影響，但地上部分無明顯癥狀，產(chǎn)量損失6%～20%。3級：主根腫瘤大且變黑，表面粗糙龜裂，有少量側(cè)根，地上部分生長受阻，中心葉片變?yōu)樯罹G色，在陽光下出現(xiàn)輕度萎蔫，產(chǎn)量損失21%～35%。4級：主根腫瘤龜裂或腐爛變黑，幾乎無側(cè)根，地上部分生長嚴(yán)重受阻，株型矮小，葉色暗綠，菜頭小且皮厚筋多，在陽光下整株嚴(yán)重萎蔫，極易拔起，產(chǎn)量損失（不包括無實際收獲價值的病株）在36%以上。

1.8 菌株的鑒定

用細菌16S rDNA通用引物27f：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1492R：5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACTT-3′，以提取的基因組DNA為模板，擴增基因序列。PCR反應(yīng)條件： 94℃ 5 min； 94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，25個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送上海生工生物工程股份有限公司測序，將測得的16S rDNA基因序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫上采用BLAST程序進行比對分析，測序結(jié)果遞交 GenBank獲取登錄號。純化后的菌株送中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測中心進行菌種鑒定。

1.9 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007和DPS V 7.05進行整理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 致腐微生物初步篩選

從腐爛處理的菌根中共分離得到112株菌株，用這些菌株接種到菌根后初步篩選得到3株可致菌根快速腐爛的菌株，分別是PB11、PB19以及PB76（圖2）。

2.2 刺激休眠孢子萌發(fā)微生物篩選

將得到的3株純培養(yǎng)的菌株再接種菌根后進行腐爛處理，制備孢子懸浮液，于顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，結(jié)果（表1）表明，用PB19進行腐爛處理后，休眠孢子的萌發(fā)率顯著高于對照及其他兩株菌株，說明PB19能促進休眠孢子的萌發(fā)。各處理下休眠孢子萌發(fā)情況如圖3所示，從圖中可以看出PB19處理的大多數(shù)孢子是空的，說明已經(jīng)萌發(fā)，而PB11、PB76處理以及CK中的大多數(shù)孢子都有內(nèi)容物，說明未萌發(fā)。

2.3 PB19與根腫菌互作的最適溫度

溫度試驗結(jié)果顯示（表2），在20℃和25℃時，休眠孢子的萌發(fā)率分別為45.67%、62.33%，顯著高于其他溫度和CK，說明PB19與根腫病菌互作的最適溫度為20～25℃，隨著溫度的升高和降低休眠孢子萌發(fā)率逐漸下降。

2.4 PB19與根腫菌互作的最適pH

用不同pH的PB19懸浮液處理根腫菌休眠孢子，結(jié)果（表3）表明，pH在5.0～7.0時休眠孢子萌發(fā)率較高，在pH 6.5時達到最高（64.33%），而在強酸以及堿性條件下萌發(fā)率較低，說明PB19與生防菌互作的最適pH在5.5～7.0。

2.5 室內(nèi)盆栽試驗

將榨菜播種于澆灌了PB19培養(yǎng)液的菌土中，結(jié)果顯示（表4）：澆灌培養(yǎng)液后，榨菜發(fā)病率和病情指數(shù)明顯低于發(fā)病對照，其中澆灌培養(yǎng)液2次和3次的植株發(fā)病率和病情指數(shù)差異不明顯，但顯著低于澆灌1次培養(yǎng)液的處理。澆灌培養(yǎng)液2次和3次對榨菜根腫病的防治效果分別為68.76%和71.96%，顯著高于澆灌1次培養(yǎng)液（22.72%），說明PB19能有效減輕榨菜根腫病的發(fā)生程度，但至少需要澆灌2次培養(yǎng)液。

2.6 田間防效

大田試驗表明各個處理的發(fā)病率均為100%，施用PB19培養(yǎng)液后，榨菜根腫病病情指數(shù)與清水對照無顯著性差異，顯著高于陽性對照（甲噻誘胺+科家）。PB19防效只有18.04%，低于陽性對照（防效23.27%）。產(chǎn)量測定結(jié)果（表5）顯示，PB19、陽性對照和清水對照處理的產(chǎn)量分別為15.0、20.7、13.2 kg，折算成667 m2產(chǎn)量后PB19的增產(chǎn)率為13.6%，低于GZB的增產(chǎn)率（28.0%）。

2.7 PB19的鑒定

PB19的16S rRNA 基因序列在GenBank上的登錄號為MF490469，純化后的菌株送中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物研究所檢測鑒定。根據(jù)16S rDNA基因序列的比對結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PB19與假單胞菌屬Pseudomonas sp.菌株高度相關(guān)，構(gòu)建的發(fā)育樹和同源性分析結(jié)果顯示PB19與假單胞菌中的湖南假單胞菌Pseudomonas hunanensis LV（JX545210）進化上的距離最近，兩者相似性為99.93%，但結(jié)合菌株的宏觀以及微觀形態(tài)、生理生化特征等試驗數(shù)據(jù)綜合分析，只能將PB19鑒定為假單胞菌屬Pseudomonas sp.。

3 結(jié)論與討論

十字花科作物根腫菌屬于專性寄生菌，可長期存活于土壤中，土壤一旦帶菌將不再適合種植十字花科作物。因此，該病嚴(yán)重威脅著十字花科作物的可持續(xù)發(fā)展，國內(nèi)外雖已進行了大量針對該病害防治技術(shù)的研究，但目前仍無根治的方法。Arie等[23]首次報道葡萄莖枯病菌Phoma glomerata JCM 9972可以抑制根腫菌休眠孢子萌發(fā)，生防菌的篩選成為該病防治的一條新途徑，但研究都集中于篩選抑制休眠孢子萌發(fā)的菌株。肖崇剛等[18]研究發(fā)現(xiàn)通過對根腫病菌根進行腐爛處理可提高休眠孢子的萌發(fā)率，且在鏡檢腐爛菌根時觀察到大量細菌存在，認(rèn)為可能是腐爛處理時細菌的作用改變了休眠孢子細胞壁的透性，從而提高了萌發(fā)率。這為我們提供了一條根腫病的防治新思路，篩選能夠促進菌根快速腐爛和孢子萌發(fā)的微生物，在寄主收獲后，施用此類微生物促進殘留在土壤中的病殘體迅速腐爛并刺激其休眠孢子萌發(fā)，從而降低田間菌源量。

本文從腐爛的菌根中分離篩選出一株能促進菌根快速腐爛并刺激休眠孢子萌發(fā)的細菌菌株P(guān)B19，其與根腫菌互作的最適溫度為20～25℃，最適pH為5.5～7.0，這些結(jié)果可為后續(xù)的防效試驗以及PB19與根腫菌的互作機制研究提供參考。

溫室盆栽試驗結(jié)果顯示澆灌培養(yǎng)液3次后，榨菜根腫病發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對照，防效為71.96%。而大田試驗結(jié)果顯示，PB19對榨菜根腫病防效只有18.04%，低于室內(nèi)防效，究其原因一方面可能是PB19的施用時間不恰當(dāng)，本研究是在榨菜移栽前一個月施用PB19培養(yǎng)液于田間的，此時的溫度濕度等環(huán)境條件不適于PB19與根腫菌的相互作用，從而導(dǎo)致PB19在田間的應(yīng)用不理想，故后期將對PB19的施用時間進行進一步的研究。另一方面可能是由于田間微生物群落相較于溫室復(fù)雜得多，每種微生物都有自己的生態(tài)位，一種新的微生物進入需要與他們競爭獲得生態(tài)位從而定殖，Miho等[24]通過光學(xué)和電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)H.chaetospira在接種3周后才能進入根部表皮細胞，故一株好的生防菌不僅需要具備好的防病效果，還應(yīng)具備強的田間定殖能力，所以可能由于PB19不能很好地在田間定殖，從而難以形成足夠數(shù)量的微生物群體進而不能穩(wěn)定發(fā)揮其拮抗作用，故關(guān)于PB19在田間的定殖能力以及施用方法還需進一步研究。

PB19經(jīng)中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物研究所（FMIC）鑒定為假單胞菌屬細菌Pseudomonas sp.，近幾十年假單胞菌被廣泛應(yīng)用于生物防治方面，非致病假單胞菌屬于植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR），是最主要的PGPR之一，已被應(yīng)用于土壤中以抑制谷物病原菌的生長[25] 。非致病假單胞菌的生防機理主要包括分泌降解微生物的酶，抗生作用和根際營養(yǎng)競爭（尤其是對鐵元素的競爭）等。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas aeruginosa K-187可產(chǎn)生溶菌酶和幾丁質(zhì)酶，能抑制36株真菌的生長。在抗生作用方面，如熒光假單胞菌產(chǎn)生的兩種典型的抗生素吩嗪酸（PCA）和2，4-二乙酰藤黃酚（Ph1）對小麥全蝕病有重要作用[27]。假單胞菌自身可產(chǎn)生嗜鐵素[28]，病原微生物不能或產(chǎn)生很少量的嗜鐵素且不能利用假單胞菌產(chǎn)生的嗜鐵素，這樣病原菌就會因缺鐵而不能生長。

綜上所述，本文從刺激根腫菌休眠孢子萌發(fā)從而減少田間菌源量的角度出發(fā)，篩選出假單胞菌PB19， 溫室盆栽試驗顯示出具有生防潛能，但田間的防治效果卻不甚理想，故對于PB19與根腫病菌的互作機制還需深入研究，以便為田間的施用時間以及方法提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）