利用酵母同源重組系統(tǒng)快速構(gòu)建柑橘葉斑駁病毒的侵染性克隆

崔甜甜，晏建紅，賓羽，李中安，周常勇，宋震

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利用酵母同源重組系統(tǒng)快速構(gòu)建柑橘葉斑駁病毒的侵染性克隆

崔甜甜，晏建紅，賓羽，李中安，周常勇，宋震

（西南大學(xué)/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所/國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

【目的】構(gòu)建柑橘葉斑駁病毒（，CLBV）中國分離株的侵染性克隆，為從分子水平解析其致病機理打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳訥eneArt? pYES1L Vector為模板，PYES2117F、PYES2117R為引物擴增含有酵母相關(guān)復(fù)制起始位點的片段pYES1L-2117，利用限制性內(nèi)切酶II單酶切雙元載體DK1317-2并回收其大片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit重組連接雙元載體DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117，得到可以在酵母-農(nóng)桿菌-大腸桿菌中復(fù)制的三元穿梭載體pCY。以馬鈴薯X病毒(,PVX)全長cDNA侵染性克隆為模板，pCY-PVX-F、pCY-PVX-R為引物擴增PVX全長，采用限制性內(nèi)切酶I、I酶切質(zhì)粒pCY，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將獲得的PVX基因組全長cDNA與線性化的pCY載體共轉(zhuǎn)化酵母菌YPH501，通過同源重組獲得PVX基因組全長cDNA克隆。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種本生煙驗證所構(gòu)建克隆的侵染性，從而建立基于酵母同源重組的病毒侵染性克隆快速構(gòu)建體系。在此基礎(chǔ)上，以CLBV中國分離物（CLBV-HBYD）全長cDNA為模板，分段擴增其基因組，得到片段CLBV-1、CLBV-2；利用所建體系對CLBV-1、CLBV-2及pCY載體片段進行同源重組。得到重組質(zhì)粒pCY-CLBV后,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種本生煙和錦橙幼苗，并利用RT-PCR和Northern blot檢測其侵染性?！窘Y(jié)果】建立了酵母-大腸桿菌-農(nóng)桿菌的三元穿梭載體PCY，該載體全長10 347 bp,含有酵母、農(nóng)桿菌、大腸桿菌的復(fù)制位點，能在酵母-農(nóng)桿菌-大腸桿菌穩(wěn)定復(fù)制，可用于在酵母中通過同源重組快速構(gòu)建病毒基因組全長cDNA克隆，也可用于通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接接種植物寄主。利用該體系獲得了CLBV中國分離株的基因組全長cDNA克隆16個。隨機選取1個克隆進行了序列測定（GenBank登錄號：MG572236），其基因組全長8 747 nt，包含3個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，ORF1為5 889 nt、ORF2為1 089 nt、ORF3為1 092 nt。全基因組序列比對顯示，CLBV-HBYD與已登錄的9個CLBV分離物的核酸序列一致性為79％—98％，其中與柑橘來源的EU857540一致性最高，為98%，與獼猴桃來源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均為79%。在利用MEGA6 軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，CLBV-HBYD與柑橘來源的CLBV分離株聚為一簇，而獼猴桃來源的CLBV分離株聚為另一簇。將所獲16個CLBV全長cDNA克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，以pCY空載體為陰性對照注射接種本生煙。接種20 d后，抽提RNA進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明11個克隆的接種植株檢測出CLBV特異性條帶；隨機選取5個陽性克隆進一步進行了Northern blot雜交，結(jié)果顯示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接種的本生煙可以檢測到CLBV特異性條帶，而對照樣本未檢測到任何條帶，表明這些克隆均為侵染性克隆。【結(jié)論】構(gòu)建了基于三元穿梭載體pCY的酵母重組克隆體系，利用該體系獲得了中國CLBV分離株的適于農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種的基因組全長cDNA侵染性克隆。

酵母同源重組；柑橘葉斑駁病毒；三元穿梭載體；侵染性克隆

0 引言

【研究意義】柑橘葉斑駁病毒（，CLBV）為乙型線形病毒科（）柑橘病毒屬（）的代表成員，可以通過嫁接侵染大多數(shù)的柑橘品種，還可以通過種子傳播[1]，因而具有一定的傳播流行風(fēng)險。構(gòu)建CLBV侵染性克隆將有助于了解其分子特性及致病機理，對于CLBV的流行防控也具有重要作用。另外，CLBV在多數(shù)柑橘品種上不會引起明顯的病毒感染癥狀，有望開發(fā)成為具有廣泛應(yīng)用前景的病毒載體?！厩叭搜芯窟M展】1968年，在美國加利福尼亞發(fā)現(xiàn)橘橙（‘Dweet’tangor，×）感染某種病毒后，葉片出現(xiàn)斑駁狀，將其病毒命名為橘橙斑駁病毒（，DMV）[2]，后來在西班牙采用嫁接鑒定技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)金橘（）感染CLBV[3]，進一步的研究確認DMV和CLBV為同種病毒的不同分離物[4-5]。隨后從多個國家的柑橘及近緣種上發(fā)現(xiàn)此病毒。1997年，日本報道了獼猴桃嫁接傳染性病害但未對其病原開展研究[6]；新西蘭于2013年首次在獼猴桃上發(fā)現(xiàn)[7]；中國于2016年在獼猴桃上發(fā)現(xiàn)[8]且在甜櫻桃首次檢測到[9]，后續(xù)在檸檬上也有報道[10]。CLBV基因組大小約為8.7 kb，包含3個開放閱讀框（open reading frame，ORF），分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白、運動蛋白及外殼蛋白，其中運動蛋白為CLBV的沉默抑制子[11]，5′端有甲基化帽子結(jié)構(gòu)，3′端有poly A尾巴[12]。感染CLBV的金橘和枳殼（）可導(dǎo)致芽接合部失調(diào)[13]，橘橙葉片斑駁以及香櫞（‘Etrog’citron，）莖痘[14]。CLBV的某些分離物可引起甜橙（‘Pineapple’）葉片脈明[3,5,13]。此外，來自中國不同地區(qū)CLBV的病株分離物間有較大的分子變異，外殼蛋白（coat protein，CP）基因核苷酸和氨基酸序列最大差異達到近18%和12%[15]，這些分離物與中國報道的CLBV櫻桃分離物核苷酸和氨基酸序列的相似性也很低?！颈狙芯壳腥朦c】侵染性克隆是深入研究病毒分子特性及病毒與寄主互作的重要基礎(chǔ)，但目前國內(nèi)外構(gòu)建侵染性克隆面臨重要問題之一是較大病毒基因組cDNA的組裝及其在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性[16]，導(dǎo)致侵染性克隆構(gòu)建費時費力，且成功率較低?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建基于三元穿梭載體的酵母同源重組系統(tǒng)，提高病毒基因組全長cDNA的組裝效率，進而通過直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌來克服病毒cDNA在大腸桿菌中可能的不穩(wěn)定性，從而快速構(gòu)建CLBV的侵染性克隆。

1 材料與方法

試驗于2017年4—11月在西南大學(xué)柑桔研究所國家柑桔苗木脫毒中心實驗室進行。

1.1 供試材料

自湖北省宜都市采集檢測具有柑橘葉斑駁病毒的柑橘枝條，將其嫁接于其他常見柑橘病毒檢測均呈陰性的代代酸橙（‘Daidai’）、西蒙斯甜橙（）的砧木上，獲得柑橘葉斑駁病毒病株，作為毒源植株。本生煙（）、錦橙（‘Jincheng’）幼苗由脫毒中心實驗室提供。PVX全長cDNA侵染性克隆由筆者實驗室提供。酵母菌株YPH501、農(nóng)桿菌菌株C58C1由法國Thierry Candresse教授惠贈。

1.2 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶II、I、I 購自北京NEB公司，PrimerSTAR MaxPremix、In-Fusion HD Cloning Kit、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、BM JM109購自大連TaKaRa公司；Trizol試劑、GeneArt? pYES1L Vector購自美國Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI中已報道CLBV全基因組序列（GenBank登錄號為AJ318061），利用Primer Priemer 5.0軟件設(shè)計擴增CLBV基因序列的特異引物。其中pCY-CLBV1F與CLBV1R、CLBV2F與pCY-CLBV2R兩對特異引物分別用于擴增大片段CLBV1、CLBV2；PYES2117F和PYES2117R用于擴增構(gòu)建穿梭載體上包含酵母能識別的復(fù)制起始位點的片段；pCY-PVX-F和pCY-PVX-R用于擴增PVX全長以驗證穿梭載體的有效性。在引物設(shè)計時，CLBV1R與CLBV2F、pCY-CLBV1F與酶切后的pCY載體、pCY-CLBV2R與酶切后的pCY載體、pCY-PVX-R與酶切后的pCY載體、pCY-PVX-F與酶切后的pCY載體之間都分別有25—30 bp的重疊序列，以便于在酵母中完成同源重組。引物均由英駿（上海）生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.4 穿梭載體的構(gòu)建

采用限制性內(nèi)切酶II單酶切雙元載體質(zhì)粒DK1317-2，得到線性化的載體。酶切反應(yīng)體系：質(zhì)粒DK1317-2 12 μL，限制性內(nèi)切酶II 2.5 μL，10×NEB Buffer 5 μL，ddH2O 23 μL。酶切反應(yīng)條件：37℃反應(yīng)0.5 h。以GeneArt? pYES1L Vector（Invitrogen公司）為模板，PYES2117F、PYES2117R為引物擴增含有酵母相關(guān)復(fù)制起始位點的片段pYES1L-2117。反應(yīng)體積為25 μL，包括ddH2O 8.5 μL，PrimerSTAR MaxPremix（2×）12.5 μL，特異性上下游引物各1 μL，模板GeneArt? pYES1L Vector 1 μL。反應(yīng)條件：98℃ 1 min，98℃℃℃ 5 min，4℃保存。然后利用DNA凝膠純化試劑盒回收目的片段。采用In-Fusion HD Cloning Kit進行構(gòu)建。重組反應(yīng)體系：線性化DK1317-2載體加2 μL，插入片段pYES1L-2117加4 μL，In-Fusion Enzyme加2 μL，ddH2O補齊至10 μL。50℃，水浴30 min，4℃保存。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BM JM109，37℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性克隆。得到可以在酵母-農(nóng)桿菌-大腸桿菌中生長的穿梭載體pCY。

1.5 穿梭載體的驗證

1.5.1 PVX全長cDNA的擴增與酶切pCY載體 擴增PVX全長，反應(yīng)體積為25 μL：ddH2O 8.5 μL，PrimerSTAR Max Premix（2×）12.5 μL，特異性上下游引物各1 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件：98℃ 1 min，98℃ 10 s，53.5℃ 15 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存。然后利用DNA凝膠純化試劑盒回收目的片段。

采用限制性內(nèi)切酶I、I酶切質(zhì)粒pCY，得到pCY線性化的載體。反應(yīng)體系：質(zhì)粒pCY 13 μL，限制性內(nèi)切酶I 1.0 μL，10×NEB Buffer 5 μL，ddH2O 31 μL。酶切反應(yīng)條件：25℃反應(yīng)0.5 h，然后再加入I 1.0 μL，37℃孵育0.5 h。

表1 引物設(shè)計及其序列

方框內(nèi)為II限制性內(nèi)切酶識別序列，下劃線部分為與pCY載體同源的30 bp

The box contains theII restriction enzyme recognition sequence, and the underlined part is 30 bp homologous to the pCY vector

1.5.2 利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母 參照YOUSSEF等采用的醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[16-17]，取制備好的酵母感受態(tài)細胞100 μL至2 mL的離心管中，按順序加入以下試劑：PEG4000（50% w/v）240 μL，1 mol·L-1的LiAc 36 μL、10 mg·mL-1的鮭魚精DNA 25 μL和pCY線性化的載體200 ng、PVX全長膠回收片段200 ng，振蕩使轉(zhuǎn)化體系中的組分充分混勻，在30℃搖床中250 r/min 搖菌30 min，42℃水浴熱激15 min；6 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，使用300 μL ddH2O重懸細胞，均勻涂布在Trp缺陷型篩選平板上，于30℃培養(yǎng)2—4 d。

1.5.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及接種本生煙 在PCR管中加入8 μL水，用牙簽挑取酵母菌落的1/3到PCR管中，98℃10 min，然后取2 μL作為模板。用檢測引物PVX-F、PVX-R檢測。篩選到的陽性菌落用牙簽蘸取后，加到含有5 mL YPD液體培養(yǎng)基10 mL離心管中。將離心管置于30℃的搖床中220 r/min搖培12—16 h，提取酵母質(zhì)粒，質(zhì)粒命名為pCY-PVX。將酵母質(zhì)粒pCY-PVX電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1中。鑒定為陽性克隆的菌液加到含對應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基（20 mg·L-1Rif，50 mg·L-1Kan），200 r/min，28℃振蕩培養(yǎng)12—16 h。離心收集菌體，用緩沖液懸?。☉腋【彌_液：10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，200 μmol·L-1As），使其OD600為0.8—1.0。靜置2 h后使用注射器接種本生煙。以pCY空載質(zhì)粒的農(nóng)桿菌作為陰性對照；以實驗室之前構(gòu)建的PVX全長cDNA侵染性克隆為陽性對照。在接種7—10 d后用RT-PCR測定其侵染性。

1.6 CLBV侵染性克隆的構(gòu)建

1.6.1 感病葉片總RNA的提取與CLBV序列的分段克隆 按照Trizol試劑說明書提取毒源植株的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以所提取感病葉片的總RNA為模版，使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），合成cDNA的第一鏈。反轉(zhuǎn)錄后以cDNA作為模板，使用兩對特異引物pCY-CLBV1F、CLBV1R與CLBV2F、pCY-CLBV2R對全長CLBV的cDNA分別進行PCR擴增，其序列分別命名為大片段CLBV1、CLBV2。PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 8.5 μL，PrimerSTAR Max Premix（2×）12.5 μL，特異性上下游引物各1 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件：98℃1 min，98℃10 s，55℃15 s，72℃2 min，35個循環(huán)；72℃5 min，4℃保存。然后利用DNA凝膠純化試劑盒回收目的片段。

1.6.2 酵母同源重組構(gòu)建CLBV的侵染性克隆 利用1.5.2醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母的方法，將CLBV1、CLBV2與PCY線性化載體在酵母體內(nèi)進行重組。培養(yǎng)2—4 d后，利用引物CLBV1F、CLBV5R對酵母菌落進行鑒定。鑒定為陽性的菌落，提取酵母質(zhì)粒，然后再利用pCY-CLBV1F、CLBV1R與CLBV2F、pCY-CLBV2R進行CLBV全長的鑒定，鑒定為全長的質(zhì)粒，命名為pCY-CLBV。

1.6.3 全長序列測序 將所得的酵母質(zhì)粒pCY-CLBV轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BM JM 109后，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果利用軟件DNAMAN（6.0）進行序列比對分析。利用DNAMAN 6.0（Lynnon Biosoft，Quebec，Canada）和MEGA6.0軟件[18]，對所獲基因組序列及目前GenBank中已登錄的CLBV序列進行比對分析。采用鄰接法（neighbor-joining，NJ），重復(fù)次數(shù)1 000，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及接種 將測序正確的克隆利用1.5.3中的方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并接種本生煙，以pCY空載質(zhì)粒的農(nóng)桿菌作為陰性對照。每個克隆接種3株，接種植株置于光照培養(yǎng)箱中，于23℃、16 h光照下培養(yǎng)，接種20 d后統(tǒng)計發(fā)病情況。

1.6.5 RT-PCR法檢測CLBV 以提取接種煙草的總RNA為模板，用引物CLBV1F、CLBV5R進行RT-PCR擴增檢測。PCR反應(yīng)體系：先后在PCR管中加入模板1 μL和ddH2O 1 μL，94℃解鏈3 min后置于冰上，加入ddH2O 2.3 μL，2×1 step buffer 5 μL，CLBV1F 0.2 μL，CLBV5R 0.2 μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 0.3 μL。反應(yīng)程序：50℃30 min，94℃2 min，94℃30 s，50℃30 s，72℃45 s，35個循環(huán)，72℃5 min，4℃停止。

1.6.6 Northern blot法檢測CLBV 探針的制備與標記：采用PCR制備探針，體系為PCR buffer with MgCl25 μL，PCR DIG Probe Synthesis Mix 5 μL，01018-F 0.5 μL，01018-R 0.5 μL，Enzyme mix 0.75 μL，模板為樣品CLBV反轉(zhuǎn)錄cDNA 1 μL，ddH2O補充至50 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火53℃30 s，延伸72℃30 s，35個循環(huán)；再延伸72℃5 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，膠回收之后保存?zhèn)溆谩?/p>

膜制備、雜交及信號檢測：制備1%甲醛變性凝膠電泳，25 v恒壓、4℃、電泳過夜。再將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)至尼龍膜。預(yù)雜交：取10.0 mL DIG Easy Hyb，加入雜交管中，50℃雜交爐中預(yù)雜交2 h；排盡預(yù)雜交液，在10.0 mL DIG Easy Hyb加入新變性好的探針，混勻，50℃雜交儀中雜交過夜。然后洗膜，最后用凝膠成像系統(tǒng)掃描尼龍膜檢測Northern blot雜交信號。

2 結(jié)果

2.1 穿梭載體pCY的構(gòu)建及驗證

以雙元載體DK1317-2為骨架進行了三元穿梭載體的構(gòu)建。首先通過內(nèi)切酶II對質(zhì)粒DK1317-2酶切后進行膠回收。以GeneArt? pYES1L Vector為模板，PYES2117F、PYES2117R為引物擴增包括酵母能識別的復(fù)制起始位點的片段pYES1L-2117。采用In-Fusion HD Cloning Kit重組連接DK1317-2酶切后的骨架和片段pYES1L-2117（圖1）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后挑選單克隆進行測序驗證，測序成功的穿梭載體命名為pCY。

為測定穿梭載體的有效性，設(shè)計特異引物pCY- PVX-F、pCY-PVX-R擴增PVX全長。采用限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ酶切質(zhì)粒pCY后膠回收。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將上述兩個大片段進行重組（圖2）。

將驗證為陽性的pCY-PVX質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1并通過農(nóng)桿菌注射浸潤本生煙，接種10 d后的觀察結(jié)果顯示，注射pCY-PVX的煙草癥狀和陽性對照的完全一樣，與陰性對照形成明顯的對比（圖3）。這說明PVX得到了高效表達，基于三元穿梭載體pCY的酵母重組克隆體系構(gòu)建成功，可用于其他病毒的侵染性克隆構(gòu)建。

2.2 柑橘葉片總RNA的提取及CLBV序列的分段擴增

從感病柑橘葉片中用Trizol 法提取出總RNA后，用1.5%普通瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。結(jié)果顯示，所提RNA效果較好，28S、18S的rRNA帶形完整，條帶明顯，表明所提取植物總RNA可用于后續(xù)試驗。以cDNA第一鏈為模版，利用兩對特異引物分段擴增CLBV序列，獲得的大片段CLBV1、CLBV2，大小分別為4 500和4 247 bp，符合預(yù)期大小并覆蓋CLBV全長。

2.3 CLBV全長cDNA的重組克隆及序列分析

切膠回收的CLBV1、CLBV2、酶切后的pCY載體共轉(zhuǎn)化酵母菌YPH501（圖4），并挑取單克隆菌落，利用特異引物CLBV1F、CLBV5R進行菌落PCR鑒定。結(jié)果表明，挑取的24個菌落中22個為PCR陽性。然后分片段PCR鑒定是否為全長cDNA，結(jié)果16個重組克隆包含CLBV全長cDNA，陽性率為71.4%。

隨機選1個全長cDNA測序，測序結(jié)果表明CLBV全長為8 747 nt，包含3個開放閱讀框，ORF1為5 889 nt、 ORF2為1 089 nt、ORF3為1 092 nt，5′末端有甲基化帽子結(jié)構(gòu)，3′末端具有poly（A）。提交GenBank后獲得登錄號MG572236。序列比對結(jié)果顯示，該序列與GenBank已登錄的其他CLBV全長序列的核苷酸一致性為79%—98%，其中與柑橘來源的EU857540一致性最高，與獼猴桃來源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均為79%。利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），可見MG572236與柑橘來源的CLBV分離株聚為一簇。

A：PCR擴增2117 bp 片段（1—4）PCR amplification of 2117 bp fragment (1-4)；B：DK1317-2質(zhì)粒的Sac II 酶切（6—9）DK1317-2 plasmid digested with Sac II (6-9)；C：穿梭載體pCY質(zhì)粒圖譜Map of shuttle vector pCY。5：空白對照Blank control ddH2O；M：DNA分子標準DNA marker

圖2 PVX全長cDNA克隆及穿梭載體pCY StuⅠ、SmaⅠ酶切電泳

圖3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)pCY-PVX接種本生煙后的癥狀

圖4 利用酵母同源重組系統(tǒng)構(gòu)建CLBV全長序列策略

圖5 CLBV全基因組核苷酸的系統(tǒng)進化樹

2.4 CLBV克隆的侵染性分析

將獲得的CLBV全長cDNA克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，以pCY空載體為陰性對照注射接種本生煙。接種20 d后，抽提RNA進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明pCY-CLBV 1、2、3、5、8、9、12、13、14、15、16接種植株檢測出CLBV特異性條帶（圖6）。說明CLBV侵染性克隆構(gòu)建成功。

M：DNA分子標準DNA marker；1：ddH2O；2：陰性對照Negative control；3—18：pCY-CLBV 1-16接種本生煙N. benthamiana inoculated by pCY-CLBV 1-16；19：陽性對照Positive control

有報道表明，本生煙接種CLBV并不表現(xiàn)明顯癥狀。為進一步確定所構(gòu)建克隆的侵染性，將RT-PCR檢測陽性的本生煙樣本隨機選取5個進行Northern blot雜交驗證，結(jié)果顯示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接本生煙可以檢測到CLBV特異性條帶，而對照樣本未檢測到任何條帶（圖7），表明pCY-CLBV 1、2、3、14、15為侵染性克隆。

此外，隨機選取5個侵染本生煙呈陽性的單克隆采用真空浸潤法接種錦橙幼苗。接種40 d后，利用RT-PCR均可以在新發(fā)葉片中檢測到CLBV特異性條帶，這進一步確認了所構(gòu)建CLBV克隆的侵染性。

1：健康對照Healthy control；2—6：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pCY-CLBV 1、2、3、14、15侵染本生煙樣品N. benthamiana agroinfiltrated by pCY-CLBV 1, 2, 3, 14, 15

3 討論

病毒與寄主的相互關(guān)系通常是病毒學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題，而該領(lǐng)域最有利的研究工具是病毒侵染性克隆的構(gòu)建。在以前的研究報道中，利用大腸桿菌構(gòu)建較大基因組RNA病毒全長cDNA侵染性克隆時，由于其自身編碼的病毒蛋白會對宿主菌產(chǎn)生毒性作用，從而導(dǎo)致非特異性重組，出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象[19-20]。這成為病毒侵染性克隆構(gòu)建面臨的最大困難和挑戰(zhàn)，也成為開展病毒深入研究工作的限制因素。病毒全長基因組克隆在大腸桿菌中存在的不穩(wěn)定現(xiàn)象的機制仍不清楚。通常利用以下幾個方法解決：（1）將病毒序列分段克隆，侵染前再短暫的連接[21]；（2）利用拷貝數(shù)目較低的載體[22]；（3）調(diào)控細菌生長的環(huán)境（如降低培養(yǎng)溫度等）來減少毒性[23]；（4）利用插入內(nèi)含子到病毒全基因組序列中來避免產(chǎn)生具有毒性的蛋白[24]。但這些方法均耗時耗力且成功率低。酵母體內(nèi)同源重組是一種利用酵母細胞內(nèi)高效的同源重組系統(tǒng)來實現(xiàn)多個相互存在同源序列DNA片段的組裝方法。本研究為了克服病毒基因組序列克隆在中的不穩(wěn)定性，首先通過In-Fusion HD Cloning Kit構(gòu)建三元穿梭載體pCY，然后利用PVX侵染性克隆建立酵母重組克隆體系；省去了轉(zhuǎn)化大腸桿菌的步驟，具有快速、便捷、成本低廉的優(yōu)點。

本研究在利用酵母同源重組系統(tǒng)構(gòu)建CLBV的侵染性克隆時發(fā)現(xiàn)，通過酵母重組獲得的CLBV全長cDNA克隆的效率可以達到70%以上。Youssef等[16]在構(gòu)建蘋果褪綠葉斑病毒（，ACLSV）時從36個經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切正確的大腸桿菌克隆中僅鑒定出1個有侵染性的克隆，表明ACLSV克隆在大腸桿菌細胞同樣存在著不穩(wěn)定性；庹德財?shù)萚25]在構(gòu)建番木瓜畸形花葉病毒（，PLDMV）時，在酵母中完成拼接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌仍然存在不穩(wěn)定現(xiàn)象，而當在PLDMV的P3基因中插入內(nèi)含子時，經(jīng)酵母重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌能獲得測序正確的克隆。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是不同的病毒在大腸桿菌中的穩(wěn)定性存在一定差異。因此，本研究為了克服病毒基因組序列克隆在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性，采用避免轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞的策略，將同源重組獲得的酵母質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，快速、便捷地構(gòu)建穩(wěn)定的適用于農(nóng)桿菌注射接種的CLBV全長cDNA侵染性克隆。

利用酵母同源重組系統(tǒng)Shang等[26]首次完成了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體桿狀病毒（，AcMNPV）全長基因組145 kb的侵染性克??；Nikiforuk等[27]通過同源重組快速一步建立了中東呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒（，MERS-CoV）約32 kb全長基因組的侵染性克隆系統(tǒng)；趙光遠等[28]也完成了番木瓜環(huán)斑病毒（，PRSV）約10 kb的侵染性克隆。對于本研究CLBV侵染性克隆構(gòu)建成功更證實了酵母同源重組對于在侵染性克隆上應(yīng)用的可行性。目前，酵母同源重組已在多個領(lǐng)域應(yīng)用，如構(gòu)建釀酒酵母新型表達質(zhì)粒[29]、制備DNA大片段[30]、基因敲除等，相信酵母同源重組系統(tǒng)在將來會有更廣闊的應(yīng)用前景，在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了一個三元穿梭載體pCY，該載體可在酵母細胞中通過同源重組快速克隆病毒全長cDNA，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)可直接接種寄主植物，還可在大腸桿菌中復(fù)制擴增；利用基于該載體的重組克隆體系，獲得了中國CLBV分離株的適于農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種的基因組全長cDNA侵染性克隆。

致謝：法國波爾多大學(xué)Thierry Candresse教授惠贈酵母菌株YPH501、農(nóng)桿菌菌株C58C1；海南大學(xué)庹德財博士對試驗進行了技術(shù)指導(dǎo)。在此一并表示感謝！

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（責任編輯 岳梅）

Construction ofinfectious cDNA clone by yeast homologous recombination system

CUI TianTian, YAN JianHong, BIN Yu, LI ZhongAn, ZHOU ChangYong, SONG Zhen

(Citrus Research Institute, Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712)

【Objective】The objective of this study is to construct infectious cDNA clone of(CLBV) isolated from China and lay a foundation for studies on the pathogenesis of CLBV at the molecular level.【Method】Using GeneArt? pYES1L Vector as a template, a 2.1-kb fragment containing the yeast replication origin and Trp-1 gene were amplified by primer pair PYES2117F/PYES2117R. Plasmid of a binary vector DK1317-2 was digested withII. The amplified and digested productions containing expected fragments were then purified with the Gel Extraction Kit and subjected to In-Fusion cloning. In this way a ternary shuttle vector pCY was obtained. Using(PVX) infectious clones as a template, pCY-PVX-F and pCY-PVX-R as primers, the full length cDNA of PVX genome was amplified. Plasmid pCY was digested with restriction endonucleaseI andI. The fragment and the linearized vector obtained above were co-transformed into yeast YPH501 by lithium acetate conversion method, and the full-length cDNA clone of PVX genome was obtained by homologous recombination. The infectivity of the resulting constructs was verified bymediated inoculation on, and a rapid cloning system based on homologous recombination in yeast cell was established for construction of viral infectious clone. On this basis, two fragments covering the full-length genome of CLBV-HBYD were amplified, and CLBV-1 and CLBV-2 were obtained. The homologous recombination was then performed to assemble CLBV-1, CLBV-2 and pCY vector fragments using the cloning system established. Then,and Jincheng () was inoculated withcarrying the recombinant plasmid pCY-CLBV. RT-PCR and Northern blot were used to detect the inoculated seedlings.【Result】A ternary yeast--shuttle vector, pCY, was constructed based on DK1317-2 and pYES1L. The vector is 10 347 bp in length and contains the replication elements of three bacteria, and can be stably replicated in yeast,, and. Using this vector, 16 full-length cDNA clones of CLBV-HBYD genome were obtained through homologous recombination in yeast cell. One clone was randomly selected and sequenced (GenBank: MG572236). Sequence analysis showed that CLBV-HBYD is 8 747 nt in length and encodes 3 open reading frames (ORF). ORF1, ORF2 and ORF3 is 5 889, 1 089 and 1 092 nt, respectively. The nucleotide sequence identity between CLBV-HBYD and 9 isolates of CLBV ranged 79%-98%, in which the highest identity was 98% with EU857540 isolate from citrus, while only 79% was seen when compared with kiwifruit isolates JN983454, JN983455, JN983456 and JN900477. In the phylogenetic tree generated by MEGA 6 software, CLBV-HBYD clustered with other citrus isolates into the same cluster. Sixteen CLBV full-length cDNA clones were inoculated onand Jincheng bymediated inoculation, and pCY empty vector was used as a negative control. After 20 days of inoculation, RNA was extracted for RT-PCR detection. The results showed that CLBV specific genes were detected in plants inoculated with 11 full-length cDNA clones of CLBV-HBYD, respectively. Five set of RT-PCR positive plants were randomly selected for further Northern blot. The results showed that specific bands of CLBV were detected by Northern blot in plants inoculated with pCY-CLBV 1, 2, 3, 14, 15, whereas no gene was detected in the control samples, indicating that these clones were infectious clones.【Conclusion】A rapid cloning system based on a ternary yeast--shuttle vector pCY and homologous recombination in yeast was constructed, and an infectious cDNA clone of Chinese isolate of CLBV was developed for the first time.

yeast homologous recombination;(CLBV); ternary shuttle vector; infectious clone

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.007

2018-01-19；

22018-03-12

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0202002）、重慶市兩江學(xué)者計劃項目、國家重點研發(fā)計劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點專項（2017YFE0110900）

崔甜甜，E-mail：15736032158@163.com。

宋震，Tel：023-68349017；E-mail：songzhen@cric.cn